BIVALENT REVERSE PRIMER

The present invention refers to a method directed to RT-qPCR reactions, preferably performed in a one or two-step approach combining the reverse transcription and subsequent PCR in a single tube and buffer, using a reverse transcriptase along with a DNA polymerase with mandatory 3' -> 5' exonuclease activity, which corrects miss-incorporated nucleotides. In particular, in this invention we present a One-step RT-PCR, preferably qPCR, method with a novel priming strategy that utilizes a novel bivalent reverse primer, wherein this primer is used for both, i) the generation of cDNA and ii) the completion of the subsequent amplification using that same cDNA as template. This bivalent reverse primer also allows end-tagging the amplicon(s) obtained so that they can be used in a variety of applications including, standard sequencing, next generation sequencing (NGS), gene expression analysis, RNAi validation, microarray validation, pathogen detection, genetic testing, and disease research. La présente invention concerne un procédé ciblant des réactions de RT-qPCR, de préférence effectuée dans une approche à une ou deux étapes combinant la transcription inverse et la PCR subséquente dans un seul tube et tampon, à l'aide d'une transcriptase inverse conjointement avec une ADN polymérase avec une activité d'exonucléase 3' vers 5' obligatoire, qui corrige des nucléotides non incorporés. En particulier, la présente invention concerne une RT-PCR en une étape, de préférence une qPCR, avec une nouvelle stratégie d'amorçage utilisant une nouvelle amorce inverse bivalente, cette amorce étant utilisée à la fois pour i) la génération d'ADNc et ii) l'achèvement de l'amplification ultérieure à l'aide du même ADNc que la matrice. Cette amorce inverse bivalente permet également le marquage final du/des amplicon(s) obtenus de telle sorte qu'ils peuvent être utilisés dans une variété d'applications comprenant le séquençage standard, le séquençage de nouvelle génération (NGS), l'analyse d'expression génique, la validation d'interférence par l'ARN, la validation de micro-réseaux, la détection de pathogènes, le test génétique et la recherche de maladies.