METHODS FOR PRODUCING PEPTIDES USING ENGINEERED INTEINS

The present invention provides a method for producing peptides by recombinant means. The peptides are expressed as part of a fusion protein comprising the target peptide and an engineered intein. The invention also provides the engineered inteins, fusion proteins comprising these, and DNA constructs coding for these fusion proteins. Upon thiol-induced cleavage of the fusion protein the carboxy-terminal a-thioester of the target peptide is obtained. The carboxy-terminal α-thioester can in principle react with any nucleophile and the strategy therefore allows a wider range of carboxy-terminal modifications such as chemical ligation, bioconjugation, or amidation. The engineered inteins of the present invention are minimized in size and has a cysteine mutation in the position corresponding by alignment to position 3 of Mxe GyrA intein (SEQ ID NO:1 ) leading to increased expression levels of the fusion protein and higher yields of the isolated target peptide, thus making the method of the invention suitable for production scale. La présente invention concerne un procédé de production de peptides par un moyen de recombinaison. Les peptides sont exprimés dans le cadre d'une protéine de fusion comprenant le peptide cible et une intéine modifiée. L'invention concerne également des intéines modifiées, des protéines de fusion les comprenant et des constructions d'ADN codant pour ces protéines de fusion. Lors d'un clivage induit par un thiol de la protéine de fusion, on obtient l'α-thioester à terminaison carboxy du peptide cible. L'α-thioester à terminaison carboxy peut en principe réagir avec n'importe quel nucléophile et la stratégie permet dès lors une gamme plus étendue de modifications de terminaisons carboxy telles qu'une ligature chimique, une bioconjugaison ou une amidation. La taille des intéines modifiées de la présente invention est minimisée et celles-ci présentent une mutation cystéine dans la position correspondant par alignement à la position 3 de l'intéine Mxe GyrA (SEQ ID No. 1) ce qui entraîne des niveaux accrus d'expression de la protéine de fusion et des rendements plus élevés du peptide cible isolé, rendant ainsi le procédé de l'invention adapté à l'échelle de la production.