IMPROVED TWO-PRIMER SEQUENCING FOR HIGH-THROUGHPUT EXPRESSION ANALYSIS

The disclosure provides a method of sequencing a nucleic acid molecule that contains two or more target regions to be sequenced (such as, for example, barcodes). The invention is advantageous for sequencing by synthesis two or more target regions whose combined lengths plus the length of any intermediate sequence exceeds the available read length on a given sequencing platform. The methods of the invention utilize nucleic acid constructs containing at least the following elements: a complement of a first universal primer, a first target sequence, an optional polynucleotide spacer, a complement of a second universal primer, and a second target sequence. Both universal primers are hybridized to the template nucleic acids, however, one of the universal primers is reversibly blocked. A first round of sequencing by synthesis is performed to sequence by elongating the unblocked universal primer. Once the sequence of a target region is obtained, the first round of sequencing is terminated. Thereafter, the remaining primer is deblocked, and a second round of sequencing by synthesis is conducted to sequence a second target region. L'invention concerne un procédé de séquençage d'une molécule d'acide nucléique qui contient deux régions cibles ou plus à séquencer (telles que, par exemple, des code-barres). L'invention est avantageuse pour séquencer par synthèse deux régions cibles ou plus dont les longueurs combinées plus la longueur de toute séquence intermédiaire dépasse la longueur de lecture disponible sur une plate-forme de séquençage donnée. Les procédés de l'invention utilisent des constructions d'acides nucléiques contenant au moins l'un des éléments suivants : un complément d'une première amorce universelle, une première séquence cible, un espaceur de polynucléotide facultatif, un complément d'une seconde amorce universelle, et une seconde séquence cible. Les deux amorces universelles sont hybridées sur les acides nucléiques de matrice, toutefois, l'une des amorces universelles est bloquée de manière réversible. Une première campagne de séquençage par synthèse est effectuée pour séquencer par allongement l'amorce universelle non bloquée. Une fois la séquence d'une région cible obtenue, la première campagne de séquençage est terminée. Ensuite, l'amorce restante est débloquée, et une seconde campagne de séquençage par synthèse est conduite pour séquencer une seconde région cible.