DETERMINATION OF THE ACTIVITY OF PROTEASES

Es werden ein Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung des Gesamtgehalts von Proteasen mit Hilfe der Messung ihrer Enzymaktivität nach vorheriger Deinhibierung offenbart. Lysosomale Proteasen sind in biologischen Proben ganz (z. B. im Blutserum) oder teilweise (z. B. in Gewebehomogenaten) inhibiert. Zur Deinhibierung wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem man ein festes Trägermaterial (z. B. Nylon oder Nitrocellulose) als Kunststoffstreifen in die Messprobe eintaucht, an dem eine Inhibitorbindesubstanz kovalent oder adsorptiv gebunden ist, die den der Protease korrespondierenden Inhibitor stärker bindet als die Protease. Nach erfolgter Deinhibierung wird der Kunststoffstreifen aus der flüssigen Messprobe entfernt und die Messprobe der Enzymaktivitätsmessung zugeführt. Als besonders vorteilhaft für die Aktivitätsmessung erweisen sich fluorogene Substrate, aus denen das Fluorogen 7-Amino-4-Trifluormethylcumarin abgespalten wird. Diese Substrate ermöglichen gegenüber den herkömmlichen AMC-Substraten im Blutserum bei der Messung in Mikrotiterplatten mit dem Fluoreszenzreader eine mindestens 10fach höhere Empfindlichkeit und damit bei dieser Messanordnung, die breite Anwendung im klinischen Labor findet, eine effektive fluorimetrische Bestimmung solcher Enzymaktivitäten im Blutserum. A method and apparatuses for determining the total content of proteases by means of measuring their enzyme activity after previous deinhibition is disclosed. In biological samples, lysosomal proteases are completely (e.g. in blood serum) or partly (e.g. in tissue homogenates) inhibited. A method proposed for the deinhibition entails immersing a solid support material (e.g. nylon or nitrocellulose) as plastic strip to which is linked, covalently or by adsorption, an inhibitor-binding substance which binds the inhibitor corresponding to the protease more strongly than the protease in the sample for measurement. After the deinhibition has taken place, the plastic strip is removed from the liquid sample for measurement, and the sample for measurement is passed on for measurement of the enzyme activity. Fluorogenic substrates from which the fluorogen 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin is eliminated proved to be particularly advantageous for the activity measurement. These substrates make it possible for the sensitivity on measurement in microtitre plates with a fluorescence reader to be at least 10 times higher compared with conventional AMC substrates in blood serum, and thus for t