ASSAY FOR DETECTION OF TRANSIENT INTRACELLULAR CA2

This invention relates to a simple end point assay for detection of transient intracellular Ca2+ with broad applicability to many Ca2+channel proteins comprising, Generation of expression constructs for the fusion proteins having the Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II (CaMKII) phosphorylation sites of NR2A or NR2B subunits of N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) or the voltage gated potassium channel of Drosophila (Eag) or any protein sequence which binds to the T-site of CaMKII similar to NR2B, conjugated to mitochondrial localizing signal sequence, or mutants of these sequences as described herein. Generation of mammalian expression constructs of a-CaMKII as a chimera with green fluorescent protein (GFP-D-CaMKII) or its mutants as described herein. Site-Directed mutagenesis, Transfection, Ca2+ stimulation, imaging and quantification of the number of cells with Ca2+-dependent signal, wherein, NMDA receptor activity assay, TRPVT receptor activity assay, GluR4 receptor activity assay are performed to detect the activity Of Ca2+ channel proteins. Cette invention porte sur un essai de point final simple pour la détection de Ca2+ intracellulaire transitoire avec une large applicabilité à de nombreuses protéines des canaux Ca2+ ; sur la génération de produits de construction d'expression pour les protéines de fusion ayant les sites de phosphorisation de la protéine kinase II (CaMKII) dépendants de Ca2+/calmoduline des sous-unités NR2A ou NR2B du récepteur de N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) ou le canal potassique sensible au potentiel de Drosophila (Eag) ou toute séquence protéinique qui se lie au site T de CaMKII analogue à NR2B, conjuguée à une séquence de signal de localisation mitochondriale ou des mutants de ces séquences telles que décrites présentement; sur la génération de produits de construction d'expression de mammifère de a-CaMKll en tant que chimère avec une protéine fluorescente verte (GFP-D-CaMKII) ou ses mutants comme décrit ici; sur une mutagenèse dirigée; sur une transfection; sur une stimulation de Ca2+ ; sur une imagerie; et sur une quantification du nombre de cellules avec un signal dépendant de Ca2+, dans lequel l'essai d'activité des récepteurs NMDA, l'essai d'activité des récepteurs TRPVT, l'essai d'activité des récepteurs GluR4 sont effectués pour détecter l'activité de protéines des canaux Ca2+.