CELL FREE BIOSYNTHESIS OF HIGH-QUALITY NUCLEIC ACID AND USES THEREOF

The invention provides an improved cell free amplification method capable of producing large quantities of therapeutic-quality nucleic acids and methods of using the synthesized nucleic acid in research, therapeutic and other applications- The methods combine several different state-of-the-art procedures and coordinate their applications to affordably synthesize nucleic acids for therapeutic purposes. It combines in vitro rolling circle amplification, high fidelity polymerases, high affinity primers, and streamlined template specifically designed for particular applications. For expression purposes, the templates contain an expression cassette including a eukaryotic promoter, the coding sequence for the gene of interest, and a eukaryotic termination sequence. Following amplification, concatamers are subsequently processed according to their intended use and may include: restriction enzyme digestion for the production of short expression cassettes (SECs); ligation steps to circularize the SEC (CNAs); and/or supercoiling steps to produce sCNAs. The final product contains nearly non-detectable levels of bacterial endotoxin. L'invention concerne une méthode d'amplification acellulaire permettant de produire de grandes quantités d'acides nucléiques de qualité thérapeutique ainsi que des méthodes d'utilisation d'un acide nucléique synthétisé à des fins de recherche, dans des applications thérapeutiques et dans d'autres applications. Ces méthodes combinent plusieurs techniques de pointe et coordonnent leurs applications en vue de la synthèse à moindres frais d'acides nucléiques à des fins thérapeutiques. L'invention combine une amplification par cercle roulant in vitro ainsi que l'utilisation de polymérases de haute fidélité, d'amorces à haute affinité et de matrices profilées spécialement conçues pour des applications particulières. A des fins d'expression, les matrices contiennent une cassette d'expression renfermant un promoteur eucaryote, la séquence codant pour le gène d'intérêt et une séquence de terminaison eucaryote. Après l'amplification, des concatamères sont traités subséquemment selon l'usage souhaité et peuvent permettre une digestion d'enzyme de restriction pour la production de cassettes d'expression courtes (SEC), des opérations de ligature destinées à circulariser les SEC (CNA) et/ou des opérations de superenroulement destinées à produire des sCNA. Le produit final présente des niveaux quasi indétectables d'endotoxine bactérienne.