DETECTION OF UNLABELED HYBRIDIZED DNA AND RNA USING RESTRICTION ENZYME DIGESTION

This invention provides a means of detecting unlabeled DNA or RNA following hybridization to an immobilized, labeled DNA probe. The immobilized DNA oligomers (probes) form a hairpin structure containing a unique restriction site that persists only when hybridization to the internal target-hybridization sequence has not occurred. Restriction enzyme digestion of unhybridized, labeled DNA probes at or above room temperature detaches the label from the surface and the label is washed away. The hairpin structure is disrupted when hybridization of the internal target-hybridization sequence occurs, removing the restriction site and preventing cleavage. In this case, the labels on target-hybridized probes remain bound to the substrate and are detected. In its preferred embodiment, a bioluminescent label is located on one end of the probe and a surface attachment moiety is on the other. Applications include characterization of mutations and single nucleotide polymorphisms in DNA and RNA, genomic fingerprinting, analysis of DNA or RNA sequence for medical diagnostics, and pathogen detection and identification. La présente invention concerne un moyen permettant la détection d'ADN et d'ARN non étiquetés après hybridation sur une sonde d'ADN immobilisée, étiquetée. Les oligomères d'ADN immobilisés (sondes) forment une structure en épingle à cheveux contenant un unique site de restriction que ne persiste que lorsque l'hybridation sur la séquence d'hybridation de la cible interne ne s'est pas produite. La digestion aux enzymes de restriction de sondes d'ADN non hybridées et étiquetées au moins à température ambiante détache de la surface l'étiquette qui disparaît au lavage. La structure en épingle à cheveux se rompt lorsque l'hybridation sur la séquence d'hybridation de la cible interne se produit, ce qui supprime le site de restriction et interdit le clivage. Dans ce cas, les étiquettes des sondes hybridées cibles restent liées au substrat où elles sont détectées. Selon le mode de réalisation préféré, une étiquette bioluminescente est située sur l'une des extrémités de la sonde, l'autre extrémité étant pourvue d'un fragment de rattachement à la surface. L'invention convient particulièrement à la caractérisation des mutations et des polymorphismes à nucléotides simples dans l'ADN et l'ARN, à la prise d'empreintes génomiques, à l'analyse de séquence d'ADN ou d'ARN pour le diagnostic médical, et à la détection et identification d'agents pathogènes.