ONE-STEP ALLELIC EXCHANGE IN MYCOBACTERIA WITH CONDITIONAL TRANSDUCING PHAGE

The present invention provides a method for high frequency of allelic exchange in the slow-growing mycobacteria using in vitro generated specialized transducing mycobacteriophages, as well as the recombinant slow-growing mycobacteria generated using the disclosed method. A transducing mycobacteriophage of the present invention comprises a conditional mycobacteriophage containing an E . coli bacteriophage lambda cosmid inserted into a non-essential region of the mycobacteriophage, said cosmid containing a mutated DNA substrate which is homologous to a wildtype nucleic acid sequence of a slow-growing mycobacterium. When slow-growing mycobacteria infected with the conditional transducing phage are cultured under conditions wherein the conditional transducing phage does not replicate, the mutated DNA substrate is incorporated into the chromosomal DNA of the slow-growing mycobacteria by homologous recombination, thereby generating the recombinant slow-growing mycobacteria of the present invention. The disclosed method may be used to produce mycobacterial auxotrophs, including leucine and lysine auxotrophs. La présente invention concerne une méthode d'échange allélique à haute fréquence dans des mycobactéries à croissance lente au moyen de mycobactériophages de transduction spécialisés créés in vitro, ainsi que les mycobactéries à croissance lente recombinées générées grâce à la méthode selon l'invention. Un mycobactériophage de transduction selon la présente invention comprend un mycobactériophage conditionnel contenant un cosmide de bactériophage lambda de E.coli introduit dans une région non essentielle du mycobactériophage, ce cosmide contenant un substrat d'ADN mutant, homologue d'une séquence d'acide nucléique de type sauvage d'un mycobactérium à croissance lente. Lorsque des mycobactéries à croissance lente infectées par le phage de transduction conditionnel sont mises en culture dans des conditions dans lesquelles le phage de transduction conditionnel ne se réplique pas, le substrat d'ADN mutant est incorporé dans l'ADN chromosomique des mycobactéries à croissance lente par recombinaison homologue, ce qui permet de créer les mycobactéries à croissance lente recombinées de la présente invention. On peut utiliser la méthode selon l'invention pour produire des auxotrophes mycobactériens, y compris des auxotrophes de leucine et de lysine.