METHOD OF REMOVING N-TERMINAL ALANINE RESIDUES FROM POLYPEPTIDES WITH AEROMONAS AMINOPEPTIDASE

This invention describes a method of removing N-terminal alanine residues from polypeptides, preferably recombinant proteins, using an aminopeptidase derived from the marine bacterium Aeromonas proteolytica. Accordingly, Aeromonas aminopeptidase (AAP; E.C. 3.4.11.10) can be used to remove N-terminal alanyl residues from derivatives of human somatotropin (hST, human growth hormone, or hGH), porcine somatotropin (pST), and bovine somtotropin (bST), for example, to yield proteins having their native amino acid sequences. The enzyme reactions can be carried out in free solution, or the AAP can be immobilized on a solid support, for reactions carried out in vitro. An efficient method for converting Ala-hGH to hGH, for example, comprises expression of Ala-hGH in E. coli, recovery of inclusion bodies, solubilization and refolding in detergent, detergent removal by ultrafiltration, selective precipitation, enzyme cleavage, followed by two column chromatography steps. L'invention concerne un procédé pour évacuer les résidus d'alanine N-terminaux de polypeptides, de préférence de protéines recombinantes, au moyen d'une aminopeptidase dérivée de la bactérie marine Aeromonas proteolytica. On peut, par conséquent, utiliser l'aminopeptidase d'Aeromonas (AAP; E.C. 3.4.11.10) pour évacuer les résidus d'alanyle N-terminaux des dérivés de la somatotropine humaine (hST, hormone humaine de la croissance ou hGH), de la somatotropine porcine (pST) et de la somatotropine bovine (bST), par exemple, pour obtenir des protéines possédant leurs séquences natives d'acides amines. Ces réactions enzymatiques peuvent être effectuées dans une solution libre, ou l'on peut aussi immobiliser l'aminopeptidase d'Aeromonas sur un support solide pour les réactions effectuées in vitro. Un procédé efficace de transformation d'Ala-hGH en hGH comprend, par exemple, l'expression de Ala-hGH dans E. coli, la récupération des corps d'inclusion, la solubilisation et le repliage dans un détergent, l'évacuation du détergent par ultrafiltration, la précipitation sélective, le clivage enzymatique puis les deux paliers de la chromatographie sur colonne.