Method of isolation and in vitro primary culture of unsorted canine glial progenitors

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób izolacji oraz hodowli pierwotnej in vitro niesortowanych psich progenitorów glejowych, który polega na tym, że tkankę nerwową pochodząca od psich płodów w stadium pomiędzy 31 i 37 dniem ciąży trawi się 3 - 10 ml (w zależności od objętości tkanki) ogrzanym środkiem enzymatycznym pochodzenia syntetycznego (TrypLe Express® (Gibco)), a następnie roztworem 10 mg/ml Deoksyrybonukleazy I (10 mg/ml; A&A Biotechnology) w temperaturze 35°C - 40°, przez 5 do 15 minut, po czym delikatnie rozdrabniana przy użyciu pipety i inkubuje przez 10 min w tych samych warunkach, następnie dodaje się 2 - 10 ml medium dedykowane do komórek nerwowych, w składzie: DMEM/F12 (500 ml; Invitrogen), suplement B27 50x (Invitrogen), suplement N2 100x (Invitrogen), albumina krwi bydlęcej (BSA; 0,5% w/v), heparyna (1 µg/ml; Sigma), a tak uzyskaną zawiesinę komórek wiruje się w 1000 rpm, przez 5 minut, w temp. pokojowej. Uzyskany osad komórkowy zawiesza się w 10 ml medium hodowlanego z dodatkiem DNA-azy 1 (10 mg/ml), a następnie inkubuje w warunkach hodowli komórkowej w 37°C, 95% wilgotności względnej oraz 5% stężeniu CO2 przez 10 minut, po czym zawiesinę komórkową poddaje się wirowaniu 1000 rpm, 5 minut, temp. pokojowa, a uzyskany osad komórkowy zawieszony w odpowiedniej ilości medium hodowlanym (minimum 20 ml na butelkę 75 cm) - z dodatkiem bFGF (20 ng/ml; PeproTech) wysiewa się na pokryte poli-L-lizyną (15 µg/ml; Sigma) oraz lamininą (15 µg/ml; Gibco) butelki hodowlane T-75 (Nunc), a hodowlę prowadzi się w 37°C, 95% wilgotności względnej w atmosferze z 5% CO2 w inkubatorze przez 5 - 10 dni (1-2 pasaże), przy czym przy każdym pasażu komórki odkleja się od dna butelki przy użyciu TrypLE Express® (3 ml) przez 3 minuty (37°C, 95% wilgotności względnej oraz 5% stężeniu CO2) po uprzednim usunięciu medium z butelki i opłukaniu ogrzanym PBS (Gibco). W celu inaktywacji czynnika enzymatycznego, do zawiesiny komórek dodaje się medium hodowlane w stosunku 2:1 (v/v), po czym komórki wiruje się 1000 rpm, 5 minut, temp. pokojowa, a w przypadku dalszej hodowli, osad komórkowy zawiesza się w medium hodowlanym a komórki wysiewa się na nową pokrytą poli-L-lizyną (15 µg/ml; Sigma) oraz lamininą (15 µg/ml; Gibco) butelkę hodowlaną T-75 (Nunc), a komórki przeznaczone do zamrożenia, pelet zawiesza się w medium ATCC (LGC Standard) i przechowuje w oparach ciekłego azotu.