EGF 제조 방법

본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 아미노산 서열: C1(X)7C2(X)4-5C3(X)10-13C4(X)C5(X)8C6 [서열번호 49]을 포함하는 상피 성장 인자-유사 펩타이드 (EGF-유사 펩타이드)의 제조 방법에 관한 것으로, 서열번호 49에서 C1-C6는 각각 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이고, EGF-유사 펩타이드는 분자내 이황화 결합 3개를 가진다: (I) N-말단 아미노산이 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 보호기 PG1에 의해 보호된, 제1 펩타이드 단편을 제조하는 단계; (II) C-말단 아미노산이 트리틸, 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기 PG2에 의해 보호된, 제2 펩타이드 단편을 제조하는 단계로서, 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편의 아미노산 측쇄들은 선택적으로 보호된, 단계; (III) 제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산을 제2 펩타이드 단편의 N-말단 아미노산과 용액 중에 커플링하여, 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드를 생성하는 단계; (IV)(a) (i) 단계 (III)에서 생성된 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 요오드를 처리하여, 산화된 혼합물을 생성하는 단계; (ii) 단계 (IV)(a)(i)에서 수득한 산화된 혼합물에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리해 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계; (iii) 단계 (IV)(a)(ii)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 DMSO/DTT를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 또는 (IV)(b) (i) 단계 (III)에서 수득한 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리하여 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계; (ii) 단계 (IV)(b)(i)에서 수득한 탈보호된 혼합물에 DMSO를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 및 (V) 선택적으로, EGF-유사 펩타이드 조산물을 정제하는 단계. 본 발명의 추가적인 측면들은 다양한 단편 축합을 이용한 EGF-유사 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a process for preparing an epidermal growth factor-like peptide (EGF-like peptide) comprising the following amino acid sequence, C1(X)7C2(X)4-5C3(X)10-13C4(X)C5(X)8C6 [SEQ NO: 49] wherein C1-C6 are each cysteine and each X is independently a natural or unnatural amino acid, and wherein said EGF-like peptide has three intramolecular disulfide bonds; said process comprising the steps of: (I) preparing a first peptide fragment wherein the N-terminal amino acid is protected by a protecting group PG1, which is selected from Boo and Fmoc; (II) preparing a second peptide fragment wherein the C-terminal amino acid is protected by a protecting group PG2, which is selected from trityl, chlorotrityl and t-butyl; and wherein the amino acid side chains in said first and second peptide fragments are optionally protected; (III) coupling the C-terminal amino acid of said first peptide fragment with the N-terminal amino acid of said second peptide fragment in solution to form a linear protected EGF-like peptide; (IV)(a)(i) treating the linear protected EGF-like peptide formed in step (III) with iodine to form an oxidized mixture; (ii) globally deprotecting the oxidized mixture obtained in step (IV)(a)(i) by treating with trifluoroacetic acid (TFA); (iii) treating the deprotected oxidized mixture obtained in step (IV)(a)(ii) with DMSO/DTT to form a cmde EGF-like peptide; or (IV)(b)(i) globally deprotecting the linear protected EGF-like