Método de detección de nucleótidos simples

Un método para determinación de la secuencia de bases nucleotídicas en un analito polinucleotídico caracterizado por los pasos de (1) generación de una corriente de trifosfatos de bases nucleotídicas simples a partir del analito por pirofosforólisis progresiva en presencia de una enzima de pirofosforólisis; (2) producción de moléculas capturadas por reacción de cada trifosfato de base nucleotídica simple en presencia de una polimerasa y una ligasa con un sistema de captura que comprende: (i) dos componentes que comprenden (a) un primer oligonucleótido que comprende una región bicatenaria y una región monocatenaria y (b) un segundo oligonucleótido monocatenario cuya secuencia de bases nucleotídicas es al menos parcialmente complementaria a la de la región monocatenaria del primer oligonucleótido; o (ii) un oligonucleótido simple que comprende una región nucleotídica monocatenaria cuyos extremos están unidos a dos regiones oligonucleotídicas bicatenarias diferentes; y en donde el sistema de captura está marcado con elementos detectables en un estado indetectable; (3) liberación de los elementos detectables de cada molécula capturada en un estado detectable utilizando una exonucleasa o la actividad de exonucleasa de una polimerasa y (4) detección de los elementos detectables así liberados y determinación de la secuencia de bases nucleotídicas a partir de ello. The present invention provides a microfluidic nucleic acid sequencing device characterised by comprising: €¢ a first zone for containing the nucleic acid to be sequenced and an enzyme for pyrophosphorolysing the nucleic acid progressively into its constituent nucleotide triphosphates; €¢ first and second microfluidic pathways for respectively introducing a first aqueous stream into the first chamber and removing a second ordered aqueous stream of the nucleotide triphosphates; €¢ a second zone connected to said second microfluidic pathway comprising a droplet head for creating microdroplets of the second aqueous stream in a water-immiscible carrier solvent, at least some of which contain a single nucleotide triphosphate; €¢ third and fourth microfluidic pathways for respectively introducing the carrier solvent into the second chamber and removing a first stream of the microdroplets in the carrier solvent therefrom; €¢ at least one contact means to contact the single nucleotide triphosphate in each microdroplet in the first stream with one or more of a pyrophosphatase, a ligase, a polymerase, a fluorophor