METODO Y COMBINACION DE REACTIVOS PARA DETERMINAR SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS

Un método para determinar la secuencia de un polímero de ácido nucleico diana que comprende: (a) combinar una muestra que contiene el polímero de ácido nucleico diana con una mezcla de nucleósido-trifosfatos, una polimerasa de ácido nucleico, y primero y segundo cebadores de multiplicación, comprendiendo cada cebador de multiplicación un oligonucleótido que tiene una región que es complementaria para y se hibrida con una cadena diferente del polímero de ácido nucleico diana y que es eficaz como cebador para polimerización de ácido nucleico por la polimerasa de ácido nucleico con objeto de formar una mezcla de multiplicación, en el cual dicho primer cebador de multiplicación comprende adicionalmente un primer resto de unión fijado al oligonucleótido; (b) ciclar repetidamente la mezcla de multiplicación entre una primera condición en la cual se produce polimerización de ADN y una segunda condición en la cual se produce desnaturalización de ADN bicatenario para dar ADN monocateneario durante un número de ciclos suficiente para producir copias del polímero de ácido nucleico diana en una cantidad adecuada para uso en un procedimiento de secuenciación de ADN con objeto de formar una muestra multiplicada que comprende copias de la secuencia de ácido nucleico diana fijadas al resto de unión; (c) añadir a la muestra multiplicada una pluralidad de primeros soportes, cada uno de los cuales comprende una matriz sólida y un primer sitio de unión que es capaz de inmovilizar una cadena del polímero de ácido nucleico diana a través del primer resto de unión; (d) dejar que los primeros sitios de unión interacciones con los primeros restos de unión de tal manera que las copias del ácido nucleico diana en la muestra multiplicada se inmovilicen sobre los primeros soportes; (e) separar los ácidos nucleicos inmovilizados a partir de la mezcla de multiplicación; (f) desnaturalizar la muestra de ácido nucleico multiplicado para formar ácidos nucleicos monocatenarios; y (g) determinar la secuencia delos ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados. The invention provides for detection of changes in a nucleotide sequence based on the determination of the nucleotide sequence over the region of interest. The first step of the process involves obtaining an amplified DNA sample in which at least one attachment moiety has been introduced into at least one strand of a target polynucleotide by a modified polymerase chain reaction. This can be accomplished by synthesizing DNA using the ta