Verfahren zur Detektion von bekannten Nukleotid-Modifikationen in einer RNA
Verfahren zur Ermittlung von Anzahl und Position (Lokus) einer ausgewählten (vorbestimmten), bekannten Nukleotid-Modifikation in einer RNA oder mehreren RNAs (inkl. Transkriptom), der (den) Template-RNA(s), umfassend die folgenden Schritte in der genannten Reihenfolge:(1) Reverse Transkription der T...
Gespeichert in:
| Hauptverfasser: | , , , , , , |
|---|---|
| Format: | Patent |
| Sprache: | ger |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Volltext bestellen |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| container_end_page | |
|---|---|
| container_issue | |
| container_start_page | |
| container_title | |
| container_volume | |
| creator | Hauenschild, Ralf Kemmer, Thomas Hildebrandt, Andreas Tserovski, Lyudmil Werner, Stephan Leclaire, Jennifer Helm, Mark |
| description | Verfahren zur Ermittlung von Anzahl und Position (Lokus) einer ausgewählten (vorbestimmten), bekannten Nukleotid-Modifikation in einer RNA oder mehreren RNAs (inkl. Transkriptom), der (den) Template-RNA(s), umfassend die folgenden Schritte in der genannten Reihenfolge:(1) Reverse Transkription der Template-RNA(s) unter Einsatz des Enzyms Reverse Transkriptase und Erstellen einer cDNA-Bibliothek enthaltend die Reverse Transkriptions-Produkte (= cDNAs) der eingesetzten Reversen Transkriptase mit dieser/diesen Template-RNA(s),(2) Amplifizierung der cDNAs und Sequenzierung der amplifizierten cDNAs mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode (Next-Generation-Sequencing (NGS)-Methode), wobei die gewonnenen Sequenz-Daten in digitaler Form, den Reads, ausgegeben werden,(3) Adapter-Trimming (= Entfernung der Adaptersequenzen) und Mapping (=Zuordnung) der sequenzierten cDNAs/Reads zum Referenzgenom oder Referenztranskriptom mittels computergestützter Alignment-Verfahren,(4) computergestützte Auswertung (Analyse) des Mappingergebnisses hinsichtlich des Reverse-Transkriptions-Ereignismusters, der RT-Signatur, unter Verwendung der Ereignisse ,Abbruch' und/oder ,Read-Through mit Mismatch' als RT-Signatur-Merkmal(e), und Diagnostizierung der RT-Signatur an jeder Nukleotid-Position der Template-RNA(s),(5) Einspeisung der digitalisierten Daten der RT-Signaturen in ein computer-basiertes, automatisches, auf überwachtem maschinellem Lernen (,,Machine-Learning") beruhendes Klassifizierungssystem,wobei in einer ersten Phase (I) des Verfahrens, der Kalibrierungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren verschiedenen, bekannten und hinsichtlich Nukleotidsequenz und gegebenenfalls vorhandener Nukleotid-Modifikation(en) identifizierten und annotierten RNAs als Template-RNAs ausgeführt werden,und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen mit der bekannten Nukleotid-Modifikation und ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen des gleichen Nukleosids ohne Nukleotid-Modifikation in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,und das Klassifizierungssystem während Trainings- und Selbsttestungsläufen implizit das (charakteristische) Profil der RT-Signatur (d.h. die charakteristische quantitative Ausprägung der RT-Signatur-Merkmale) an der die Nukleotid-Modifikation aufweisenden Nukleotid-Position erstellt und optimiert (,,erlernt"), und (infolgedessen) als Klassifizierungsergebnis diejenigen Positionen auf der/den (jeder) Template-RNA(s |
| format | Patent |
| fullrecord | <record><control><sourceid>epo_EVB</sourceid><recordid>TN_cdi_epo_espacenet_DE102017002092B4</recordid><sourceformat>XML</sourceformat><sourcesystem>PC</sourcesystem><sourcerecordid>DE102017002092B4</sourcerecordid><originalsourceid>FETCH-epo_espacenet_DE102017002092B43</originalsourceid><addsrcrecordid>eNrjZPAOSy1KS8woSs1TqCotUnBJLUnNLsnMz1MoA-Kk1OzEvLwSoJxfaXZOan5JZoqub35KZlpmdiJIEVAiM08hNTMvtUghyM-Rh4E1LTGnOJUXSnMzqLq5hjh76KYW5MenFhckJqfmpZbEu7gaGhgZGJobAElLIycTY2LVAQD4vzau</addsrcrecordid><sourcetype>Open Access Repository</sourcetype><iscdi>true</iscdi><recordtype>patent</recordtype></control><display><type>patent</type><title>Verfahren zur Detektion von bekannten Nukleotid-Modifikationen in einer RNA</title><source>esp@cenet</source><creator>Hauenschild, Ralf ; Kemmer, Thomas ; Hildebrandt, Andreas ; Tserovski, Lyudmil ; Werner, Stephan ; Leclaire, Jennifer ; Helm, Mark</creator><creatorcontrib>Hauenschild, Ralf ; Kemmer, Thomas ; Hildebrandt, Andreas ; Tserovski, Lyudmil ; Werner, Stephan ; Leclaire, Jennifer ; Helm, Mark</creatorcontrib><description>Verfahren zur Ermittlung von Anzahl und Position (Lokus) einer ausgewählten (vorbestimmten), bekannten Nukleotid-Modifikation in einer RNA oder mehreren RNAs (inkl. Transkriptom), der (den) Template-RNA(s), umfassend die folgenden Schritte in der genannten Reihenfolge:(1) Reverse Transkription der Template-RNA(s) unter Einsatz des Enzyms Reverse Transkriptase und Erstellen einer cDNA-Bibliothek enthaltend die Reverse Transkriptions-Produkte (= cDNAs) der eingesetzten Reversen Transkriptase mit dieser/diesen Template-RNA(s),(2) Amplifizierung der cDNAs und Sequenzierung der amplifizierten cDNAs mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode (Next-Generation-Sequencing (NGS)-Methode), wobei die gewonnenen Sequenz-Daten in digitaler Form, den Reads, ausgegeben werden,(3) Adapter-Trimming (= Entfernung der Adaptersequenzen) und Mapping (=Zuordnung) der sequenzierten cDNAs/Reads zum Referenzgenom oder Referenztranskriptom mittels computergestützter Alignment-Verfahren,(4) computergestützte Auswertung (Analyse) des Mappingergebnisses hinsichtlich des Reverse-Transkriptions-Ereignismusters, der RT-Signatur, unter Verwendung der Ereignisse ,Abbruch' und/oder ,Read-Through mit Mismatch' als RT-Signatur-Merkmal(e), und Diagnostizierung der RT-Signatur an jeder Nukleotid-Position der Template-RNA(s),(5) Einspeisung der digitalisierten Daten der RT-Signaturen in ein computer-basiertes, automatisches, auf überwachtem maschinellem Lernen (,,Machine-Learning") beruhendes Klassifizierungssystem,wobei in einer ersten Phase (I) des Verfahrens, der Kalibrierungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren verschiedenen, bekannten und hinsichtlich Nukleotidsequenz und gegebenenfalls vorhandener Nukleotid-Modifikation(en) identifizierten und annotierten RNAs als Template-RNAs ausgeführt werden,und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen mit der bekannten Nukleotid-Modifikation und ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen des gleichen Nukleosids ohne Nukleotid-Modifikation in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,und das Klassifizierungssystem während Trainings- und Selbsttestungsläufen implizit das (charakteristische) Profil der RT-Signatur (d.h. die charakteristische quantitative Ausprägung der RT-Signatur-Merkmale) an der die Nukleotid-Modifikation aufweisenden Nukleotid-Position erstellt und optimiert (,,erlernt"), und (infolgedessen) als Klassifizierungsergebnis diejenigen Positionen auf der/den (jeder) Template-RNA(s) ermittelt und angibt, die eine RT-Signatur aufweisen, die mit diesem (charakteristischen) Profil annähernd oder vollständig übereinstimmt, und die somit auf das Vorliegen der betreffenden Nukleotid-Modifikation an diesen Positionen hinweist,und wobei in einer zweiten Phase (II) des Verfahrens, der Anwendungs- bzw. Untersuchungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren zu untersuchenden unbekannten Test-RNA(s) als Template-RNA(s) durchgeführt werden,- und die Schritte (1) bis (4) unter den gleichen Bedingungen wie in Phase (I) erfolgen,- und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen der Test-Template-RNA(s) in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,- und das Klassifizierungssystem auf der Basis des in Phase (I) Schritt (5) implizit erlernten (charakteristischen) Profils die eingegebenen RT-Signaturen dahingehend klassifiziert, inwieweit sie diesem Profil ähnlich sind oder damit übereinstimmen, und wobei Klassifizierungsergebnisse mit der Aussage ,,ähnlich" oder ,,annähernd übereinstimmend" oder ,,übereinstimmend" auf das Vorliegen der betreffenden Nukleotid-Modifikation in der/den Test-Template-RNA(s) an der Nukleotid-Position mit dieser RT-Signatur hinweisen,dadurch gekennzeichnet,dass in Schritt (1) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens die Reverse Transkription der Template-RNAs in zwei oder mehr Reaktionsansätzen und - durchläufen mit voneinander verschiedenen Reversen Transkriptasen unter den gleichen Reaktionsbedingungen und/oder mit (der) gleichen Reversen Transkriptase(n) unter voneinander abweichenden Reaktionsbedingungen je Ansatz durchgeführt wird, wobei mit/von jedem Ansatz eine cDNA-Bibliothek erhalten wird,dass in Schritt (4) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens die Auswertung der Mapping-Ergebnisse hinsichtlich der RT-Signatur unter Verwendung der Ereignisse ,Abbruch' und/oder ,Read-Through mit Mismatch' und/oder des zusätzlichen Ereignisses ,Read-Through mit Sequenzlücke(n)' als RT-Signatur-Merkmal(e) erfolgt,und dass in Schritt (5) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens Daten von RT-Signaturen aus den in Schritt (1) mit den verschiedenen Reversen Transkriptasen unter gleichen Reaktionsbedingungen und/oder mit der/den gleichen Reversen Transkriptase(n) unter voneinander abweichenden Reaktionsbedingungen erhaltenen cDNA-Bibliotheken in das Klassifizierungssystem eingespeist werden.
The method comprises: the reverse transcription of the template RNA, the amplification and high-throughput sequencing of the cDNAs obtained in this way, the mapping of the sequenced cDNAs/reads to the reference genome using computerized alignment methods, a computerized evaluation of the mapping results with regard to the reverse transcription event pattern (the RT signature) at the nucleotide positions and feeding the digitalised data of the RT signatures into a computerized machine learning based classification system. Reverse transcription is carried out in parallel reaction batches with different reverse transcriptases and/or under different reaction conditions. The evaluation of the mapping results with regard to the RT signature is carried out using the events 'arrest' and/or 'readthrough with mismatch' and/or 'readthrough with sequence gap(s)'. RT signature data obtained using the parallel reaction batches are fed into the classification system.</description><language>ger</language><subject>BEER ; BIOCHEMISTRY ; CHEMISTRY ; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR ; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL ORENZYMOLOGICAL PROCESSES ; ENZYMOLOGY ; MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEICACIDS OR MICROORGANISMS ; METALLURGY ; MICROBIOLOGY ; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING ; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS ; SPIRITS ; VINEGAR ; WINE</subject><creationdate>2018</creationdate><oa>free_for_read</oa><woscitedreferencessubscribed>false</woscitedreferencessubscribed></display><links><openurl>$$Topenurl_article</openurl><openurlfulltext>$$Topenurlfull_article</openurlfulltext><thumbnail>$$Tsyndetics_thumb_exl</thumbnail><linktohtml>$$Uhttps://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/biblio?FT=D&date=20181108&DB=EPODOC&CC=DE&NR=102017002092B4$$EHTML$$P50$$Gepo$$Hfree_for_read</linktohtml><link.rule.ids>230,308,780,885,25564,76547</link.rule.ids><linktorsrc>$$Uhttps://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/biblio?FT=D&date=20181108&DB=EPODOC&CC=DE&NR=102017002092B4$$EView_record_in_European_Patent_Office$$FView_record_in_$$GEuropean_Patent_Office$$Hfree_for_read</linktorsrc></links><search><creatorcontrib>Hauenschild, Ralf</creatorcontrib><creatorcontrib>Kemmer, Thomas</creatorcontrib><creatorcontrib>Hildebrandt, Andreas</creatorcontrib><creatorcontrib>Tserovski, Lyudmil</creatorcontrib><creatorcontrib>Werner, Stephan</creatorcontrib><creatorcontrib>Leclaire, Jennifer</creatorcontrib><creatorcontrib>Helm, Mark</creatorcontrib><title>Verfahren zur Detektion von bekannten Nukleotid-Modifikationen in einer RNA</title><description>Verfahren zur Ermittlung von Anzahl und Position (Lokus) einer ausgewählten (vorbestimmten), bekannten Nukleotid-Modifikation in einer RNA oder mehreren RNAs (inkl. Transkriptom), der (den) Template-RNA(s), umfassend die folgenden Schritte in der genannten Reihenfolge:(1) Reverse Transkription der Template-RNA(s) unter Einsatz des Enzyms Reverse Transkriptase und Erstellen einer cDNA-Bibliothek enthaltend die Reverse Transkriptions-Produkte (= cDNAs) der eingesetzten Reversen Transkriptase mit dieser/diesen Template-RNA(s),(2) Amplifizierung der cDNAs und Sequenzierung der amplifizierten cDNAs mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode (Next-Generation-Sequencing (NGS)-Methode), wobei die gewonnenen Sequenz-Daten in digitaler Form, den Reads, ausgegeben werden,(3) Adapter-Trimming (= Entfernung der Adaptersequenzen) und Mapping (=Zuordnung) der sequenzierten cDNAs/Reads zum Referenzgenom oder Referenztranskriptom mittels computergestützter Alignment-Verfahren,(4) computergestützte Auswertung (Analyse) des Mappingergebnisses hinsichtlich des Reverse-Transkriptions-Ereignismusters, der RT-Signatur, unter Verwendung der Ereignisse ,Abbruch' und/oder ,Read-Through mit Mismatch' als RT-Signatur-Merkmal(e), und Diagnostizierung der RT-Signatur an jeder Nukleotid-Position der Template-RNA(s),(5) Einspeisung der digitalisierten Daten der RT-Signaturen in ein computer-basiertes, automatisches, auf überwachtem maschinellem Lernen (,,Machine-Learning") beruhendes Klassifizierungssystem,wobei in einer ersten Phase (I) des Verfahrens, der Kalibrierungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren verschiedenen, bekannten und hinsichtlich Nukleotidsequenz und gegebenenfalls vorhandener Nukleotid-Modifikation(en) identifizierten und annotierten RNAs als Template-RNAs ausgeführt werden,und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen mit der bekannten Nukleotid-Modifikation und ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen des gleichen Nukleosids ohne Nukleotid-Modifikation in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,und das Klassifizierungssystem während Trainings- und Selbsttestungsläufen implizit das (charakteristische) Profil der RT-Signatur (d.h. die charakteristische quantitative Ausprägung der RT-Signatur-Merkmale) an der die Nukleotid-Modifikation aufweisenden Nukleotid-Position erstellt und optimiert (,,erlernt"), und (infolgedessen) als Klassifizierungsergebnis diejenigen Positionen auf der/den (jeder) Template-RNA(s) ermittelt und angibt, die eine RT-Signatur aufweisen, die mit diesem (charakteristischen) Profil annähernd oder vollständig übereinstimmt, und die somit auf das Vorliegen der betreffenden Nukleotid-Modifikation an diesen Positionen hinweist,und wobei in einer zweiten Phase (II) des Verfahrens, der Anwendungs- bzw. Untersuchungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren zu untersuchenden unbekannten Test-RNA(s) als Template-RNA(s) durchgeführt werden,- und die Schritte (1) bis (4) unter den gleichen Bedingungen wie in Phase (I) erfolgen,- und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen der Test-Template-RNA(s) in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,- und das Klassifizierungssystem auf der Basis des in Phase (I) Schritt (5) implizit erlernten (charakteristischen) Profils die eingegebenen RT-Signaturen dahingehend klassifiziert, inwieweit sie diesem Profil ähnlich sind oder damit übereinstimmen, und wobei Klassifizierungsergebnisse mit der Aussage ,,ähnlich" oder ,,annähernd übereinstimmend" oder ,,übereinstimmend" auf das Vorliegen der betreffenden Nukleotid-Modifikation in der/den Test-Template-RNA(s) an der Nukleotid-Position mit dieser RT-Signatur hinweisen,dadurch gekennzeichnet,dass in Schritt (1) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens die Reverse Transkription der Template-RNAs in zwei oder mehr Reaktionsansätzen und - durchläufen mit voneinander verschiedenen Reversen Transkriptasen unter den gleichen Reaktionsbedingungen und/oder mit (der) gleichen Reversen Transkriptase(n) unter voneinander abweichenden Reaktionsbedingungen je Ansatz durchgeführt wird, wobei mit/von jedem Ansatz eine cDNA-Bibliothek erhalten wird,dass in Schritt (4) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens die Auswertung der Mapping-Ergebnisse hinsichtlich der RT-Signatur unter Verwendung der Ereignisse ,Abbruch' und/oder ,Read-Through mit Mismatch' und/oder des zusätzlichen Ereignisses ,Read-Through mit Sequenzlücke(n)' als RT-Signatur-Merkmal(e) erfolgt,und dass in Schritt (5) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens Daten von RT-Signaturen aus den in Schritt (1) mit den verschiedenen Reversen Transkriptasen unter gleichen Reaktionsbedingungen und/oder mit der/den gleichen Reversen Transkriptase(n) unter voneinander abweichenden Reaktionsbedingungen erhaltenen cDNA-Bibliotheken in das Klassifizierungssystem eingespeist werden.
The method comprises: the reverse transcription of the template RNA, the amplification and high-throughput sequencing of the cDNAs obtained in this way, the mapping of the sequenced cDNAs/reads to the reference genome using computerized alignment methods, a computerized evaluation of the mapping results with regard to the reverse transcription event pattern (the RT signature) at the nucleotide positions and feeding the digitalised data of the RT signatures into a computerized machine learning based classification system. Reverse transcription is carried out in parallel reaction batches with different reverse transcriptases and/or under different reaction conditions. The evaluation of the mapping results with regard to the RT signature is carried out using the events 'arrest' and/or 'readthrough with mismatch' and/or 'readthrough with sequence gap(s)'. RT signature data obtained using the parallel reaction batches are fed into the classification system.</description><subject>BEER</subject><subject>BIOCHEMISTRY</subject><subject>CHEMISTRY</subject><subject>COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR</subject><subject>CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL ORENZYMOLOGICAL PROCESSES</subject><subject>ENZYMOLOGY</subject><subject>MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEICACIDS OR MICROORGANISMS</subject><subject>METALLURGY</subject><subject>MICROBIOLOGY</subject><subject>MUTATION OR GENETIC ENGINEERING</subject><subject>PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS</subject><subject>SPIRITS</subject><subject>VINEGAR</subject><subject>WINE</subject><fulltext>true</fulltext><rsrctype>patent</rsrctype><creationdate>2018</creationdate><recordtype>patent</recordtype><sourceid>EVB</sourceid><recordid>eNrjZPAOSy1KS8woSs1TqCotUnBJLUnNLsnMz1MoA-Kk1OzEvLwSoJxfaXZOan5JZoqub35KZlpmdiJIEVAiM08hNTMvtUghyM-Rh4E1LTGnOJUXSnMzqLq5hjh76KYW5MenFhckJqfmpZbEu7gaGhgZGJobAElLIycTY2LVAQD4vzau</recordid><startdate>20181108</startdate><enddate>20181108</enddate><creator>Hauenschild, Ralf</creator><creator>Kemmer, Thomas</creator><creator>Hildebrandt, Andreas</creator><creator>Tserovski, Lyudmil</creator><creator>Werner, Stephan</creator><creator>Leclaire, Jennifer</creator><creator>Helm, Mark</creator><scope>EVB</scope></search><sort><creationdate>20181108</creationdate><title>Verfahren zur Detektion von bekannten Nukleotid-Modifikationen in einer RNA</title><author>Hauenschild, Ralf ; Kemmer, Thomas ; Hildebrandt, Andreas ; Tserovski, Lyudmil ; Werner, Stephan ; Leclaire, Jennifer ; Helm, Mark</author></sort><facets><frbrtype>5</frbrtype><frbrgroupid>cdi_FETCH-epo_espacenet_DE102017002092B43</frbrgroupid><rsrctype>patents</rsrctype><prefilter>patents</prefilter><language>ger</language><creationdate>2018</creationdate><topic>BEER</topic><topic>BIOCHEMISTRY</topic><topic>CHEMISTRY</topic><topic>COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR</topic><topic>CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL ORENZYMOLOGICAL PROCESSES</topic><topic>ENZYMOLOGY</topic><topic>MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEICACIDS OR MICROORGANISMS</topic><topic>METALLURGY</topic><topic>MICROBIOLOGY</topic><topic>MUTATION OR GENETIC ENGINEERING</topic><topic>PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS</topic><topic>SPIRITS</topic><topic>VINEGAR</topic><topic>WINE</topic><toplevel>online_resources</toplevel><creatorcontrib>Hauenschild, Ralf</creatorcontrib><creatorcontrib>Kemmer, Thomas</creatorcontrib><creatorcontrib>Hildebrandt, Andreas</creatorcontrib><creatorcontrib>Tserovski, Lyudmil</creatorcontrib><creatorcontrib>Werner, Stephan</creatorcontrib><creatorcontrib>Leclaire, Jennifer</creatorcontrib><creatorcontrib>Helm, Mark</creatorcontrib><collection>esp@cenet</collection></facets><delivery><delcategory>Remote Search Resource</delcategory><fulltext>fulltext_linktorsrc</fulltext></delivery><addata><au>Hauenschild, Ralf</au><au>Kemmer, Thomas</au><au>Hildebrandt, Andreas</au><au>Tserovski, Lyudmil</au><au>Werner, Stephan</au><au>Leclaire, Jennifer</au><au>Helm, Mark</au><format>patent</format><genre>patent</genre><ristype>GEN</ristype><title>Verfahren zur Detektion von bekannten Nukleotid-Modifikationen in einer RNA</title><date>2018-11-08</date><risdate>2018</risdate><abstract>Verfahren zur Ermittlung von Anzahl und Position (Lokus) einer ausgewählten (vorbestimmten), bekannten Nukleotid-Modifikation in einer RNA oder mehreren RNAs (inkl. Transkriptom), der (den) Template-RNA(s), umfassend die folgenden Schritte in der genannten Reihenfolge:(1) Reverse Transkription der Template-RNA(s) unter Einsatz des Enzyms Reverse Transkriptase und Erstellen einer cDNA-Bibliothek enthaltend die Reverse Transkriptions-Produkte (= cDNAs) der eingesetzten Reversen Transkriptase mit dieser/diesen Template-RNA(s),(2) Amplifizierung der cDNAs und Sequenzierung der amplifizierten cDNAs mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode (Next-Generation-Sequencing (NGS)-Methode), wobei die gewonnenen Sequenz-Daten in digitaler Form, den Reads, ausgegeben werden,(3) Adapter-Trimming (= Entfernung der Adaptersequenzen) und Mapping (=Zuordnung) der sequenzierten cDNAs/Reads zum Referenzgenom oder Referenztranskriptom mittels computergestützter Alignment-Verfahren,(4) computergestützte Auswertung (Analyse) des Mappingergebnisses hinsichtlich des Reverse-Transkriptions-Ereignismusters, der RT-Signatur, unter Verwendung der Ereignisse ,Abbruch' und/oder ,Read-Through mit Mismatch' als RT-Signatur-Merkmal(e), und Diagnostizierung der RT-Signatur an jeder Nukleotid-Position der Template-RNA(s),(5) Einspeisung der digitalisierten Daten der RT-Signaturen in ein computer-basiertes, automatisches, auf überwachtem maschinellem Lernen (,,Machine-Learning") beruhendes Klassifizierungssystem,wobei in einer ersten Phase (I) des Verfahrens, der Kalibrierungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren verschiedenen, bekannten und hinsichtlich Nukleotidsequenz und gegebenenfalls vorhandener Nukleotid-Modifikation(en) identifizierten und annotierten RNAs als Template-RNAs ausgeführt werden,und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen mit der bekannten Nukleotid-Modifikation und ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen des gleichen Nukleosids ohne Nukleotid-Modifikation in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,und das Klassifizierungssystem während Trainings- und Selbsttestungsläufen implizit das (charakteristische) Profil der RT-Signatur (d.h. die charakteristische quantitative Ausprägung der RT-Signatur-Merkmale) an der die Nukleotid-Modifikation aufweisenden Nukleotid-Position erstellt und optimiert (,,erlernt"), und (infolgedessen) als Klassifizierungsergebnis diejenigen Positionen auf der/den (jeder) Template-RNA(s) ermittelt und angibt, die eine RT-Signatur aufweisen, die mit diesem (charakteristischen) Profil annähernd oder vollständig übereinstimmt, und die somit auf das Vorliegen der betreffenden Nukleotid-Modifikation an diesen Positionen hinweist,und wobei in einer zweiten Phase (II) des Verfahrens, der Anwendungs- bzw. Untersuchungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren zu untersuchenden unbekannten Test-RNA(s) als Template-RNA(s) durchgeführt werden,- und die Schritte (1) bis (4) unter den gleichen Bedingungen wie in Phase (I) erfolgen,- und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen der Test-Template-RNA(s) in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,- und das Klassifizierungssystem auf der Basis des in Phase (I) Schritt (5) implizit erlernten (charakteristischen) Profils die eingegebenen RT-Signaturen dahingehend klassifiziert, inwieweit sie diesem Profil ähnlich sind oder damit übereinstimmen, und wobei Klassifizierungsergebnisse mit der Aussage ,,ähnlich" oder ,,annähernd übereinstimmend" oder ,,übereinstimmend" auf das Vorliegen der betreffenden Nukleotid-Modifikation in der/den Test-Template-RNA(s) an der Nukleotid-Position mit dieser RT-Signatur hinweisen,dadurch gekennzeichnet,dass in Schritt (1) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens die Reverse Transkription der Template-RNAs in zwei oder mehr Reaktionsansätzen und - durchläufen mit voneinander verschiedenen Reversen Transkriptasen unter den gleichen Reaktionsbedingungen und/oder mit (der) gleichen Reversen Transkriptase(n) unter voneinander abweichenden Reaktionsbedingungen je Ansatz durchgeführt wird, wobei mit/von jedem Ansatz eine cDNA-Bibliothek erhalten wird,dass in Schritt (4) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens die Auswertung der Mapping-Ergebnisse hinsichtlich der RT-Signatur unter Verwendung der Ereignisse ,Abbruch' und/oder ,Read-Through mit Mismatch' und/oder des zusätzlichen Ereignisses ,Read-Through mit Sequenzlücke(n)' als RT-Signatur-Merkmal(e) erfolgt,und dass in Schritt (5) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens Daten von RT-Signaturen aus den in Schritt (1) mit den verschiedenen Reversen Transkriptasen unter gleichen Reaktionsbedingungen und/oder mit der/den gleichen Reversen Transkriptase(n) unter voneinander abweichenden Reaktionsbedingungen erhaltenen cDNA-Bibliotheken in das Klassifizierungssystem eingespeist werden.
The method comprises: the reverse transcription of the template RNA, the amplification and high-throughput sequencing of the cDNAs obtained in this way, the mapping of the sequenced cDNAs/reads to the reference genome using computerized alignment methods, a computerized evaluation of the mapping results with regard to the reverse transcription event pattern (the RT signature) at the nucleotide positions and feeding the digitalised data of the RT signatures into a computerized machine learning based classification system. Reverse transcription is carried out in parallel reaction batches with different reverse transcriptases and/or under different reaction conditions. The evaluation of the mapping results with regard to the RT signature is carried out using the events 'arrest' and/or 'readthrough with mismatch' and/or 'readthrough with sequence gap(s)'. RT signature data obtained using the parallel reaction batches are fed into the classification system.</abstract><oa>free_for_read</oa></addata></record> |
| fulltext | fulltext_linktorsrc |
| identifier | |
| ispartof | |
| issn | |
| language | ger |
| recordid | cdi_epo_espacenet_DE102017002092B4 |
| source | esp@cenet |
| subjects | BEER BIOCHEMISTRY CHEMISTRY COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL ORENZYMOLOGICAL PROCESSES ENZYMOLOGY MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEICACIDS OR MICROORGANISMS METALLURGY MICROBIOLOGY MUTATION OR GENETIC ENGINEERING PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS SPIRITS VINEGAR WINE |
| title | Verfahren zur Detektion von bekannten Nukleotid-Modifikationen in einer RNA |
| url | https://sfx.bib-bvb.de/sfx_tum?ctx_ver=Z39.88-2004&ctx_enc=info:ofi/enc:UTF-8&ctx_tim=2025-01-04T16%3A00%3A17IST&url_ver=Z39.88-2004&url_ctx_fmt=infofi/fmt:kev:mtx:ctx&rfr_id=info:sid/primo.exlibrisgroup.com:primo3-Article-epo_EVB&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:patent&rft.genre=patent&rft.au=Hauenschild,%20Ralf&rft.date=2018-11-08&rft_id=info:doi/&rft_dat=%3Cepo_EVB%3EDE102017002092B4%3C/epo_EVB%3E%3Curl%3E%3C/url%3E&disable_directlink=true&sfx.directlink=off&sfx.report_link=0&rft_id=info:oai/&rft_id=info:pmid/&rfr_iscdi=true |