Verfahren zur Detektion von bekannten Nukleotid-Modifikationen in einer RNA

Verfahren zur Ermittlung von Anzahl und Position (Lokus) einer ausgewählten (vorbestimmten), bekannten Nukleotid-Modifikation in einer RNA oder mehreren RNAs (inkl. Transkriptom), der (den) Template-RNA(s), umfassend die folgenden Schritte in der genannten Reihenfolge:(1) Reverse Transkription der Template-RNA(s) unter Einsatz des Enzyms Reverse Transkriptase und Erstellen einer cDNA-Bibliothek enthaltend die Reverse Transkriptions-Produkte (= cDNAs) der eingesetzten Reversen Transkriptase mit dieser/diesen Template-RNA(s),(2) Amplifizierung der cDNAs und Sequenzierung der amplifizierten cDNAs mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode (Next-Generation-Sequencing (NGS)-Methode), wobei die gewonnenen Sequenz-Daten in digitaler Form, den Reads, ausgegeben werden,(3) Adapter-Trimming (= Entfernung der Adaptersequenzen) und Mapping (=Zuordnung) der sequenzierten cDNAs/Reads zum Referenzgenom oder Referenztranskriptom mittels computergestützter Alignment-Verfahren,(4) computergestützte Auswertung (Analyse) des Mappingergebnisses hinsichtlich des Reverse-Transkriptions-Ereignismusters, der RT-Signatur, unter Verwendung der Ereignisse ,Abbruch' und/oder ,Read-Through mit Mismatch' als RT-Signatur-Merkmal(e), und Diagnostizierung der RT-Signatur an jeder Nukleotid-Position der Template-RNA(s),(5) Einspeisung der digitalisierten Daten der RT-Signaturen in ein computer-basiertes, automatisches, auf überwachtem maschinellem Lernen (,,Machine-Learning") beruhendes Klassifizierungssystem,wobei in einer ersten Phase (I) des Verfahrens, der Kalibrierungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren verschiedenen, bekannten und hinsichtlich Nukleotidsequenz und gegebenenfalls vorhandener Nukleotid-Modifikation(en) identifizierten und annotierten RNAs als Template-RNAs ausgeführt werden,und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen mit der bekannten Nukleotid-Modifikation und ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen des gleichen Nukleosids ohne Nukleotid-Modifikation in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,und das Klassifizierungssystem während Trainings- und Selbsttestungsläufen implizit das (charakteristische) Profil der RT-Signatur (d.h. die charakteristische quantitative Ausprägung der RT-Signatur-Merkmale) an der die Nukleotid-Modifikation aufweisenden Nukleotid-Position erstellt und optimiert (,,erlernt"), und (infolgedessen) als Klassifizierungsergebnis diejenigen Positionen auf der/den (jeder) Template-RNA(s