Purification of murine heat shock protein 90-beta (84 KDA) from mice tumor cell line

جرى تنقية بروتين الصدمة الحراري 90 نمط بيتا من سايتوبلازم خط خلايا AMN3 (خط خلايا سرطان الغدة اللبنية الفأري المستحدث محليا). لا يوجد لهذا البروتين اختبار فحص الفعالية المعتمد بـشكل نمطـي فـي تنقيـة البروتينات لذا أستعمل وزنه الجزيئي كأحد الأدلة على وجوده خلال مختلـف مراحـل التنقيـة. أظهـر الترحيـل الكهربائي باستعمال الأكرل أمايد المتعدد بوجود المادة الماسخة (SDS) لبروتين ساتوبلازم الخلايا وجـود حـزم بروتينية تراوح وزنها الجزيئي بين 23.4 و85.1 كيلودالتن. رسبت بروتينات السايتوبلازم بوساطة ملح كبريتات الأمونيوم بنسبة إشباع 70 % وأظهر أنه يحتوي حزم بروتينيـة تـراوح وزنهـا الجزيئـي بـين 31.6 و 93.3 كيلودالتون. أظهرت نتائج خطوة التبادل الآيوني باستعمال المبادل الآيوني ثنائي أثيل أمينوأثيل سليلوز –(DEAE Cellulose) للبروتينات المترسبة بكبريتات الأمونيوم وجود قمة واحدة أستردت بتدرج ملحي تراوح بـين 0.5– 0.7 مولرمن كلوريد الصوديوم و احتوت أربعة حزم بروتينية تراوح الوزن الجزيئـي لهـا بـين 17.3 و 85.1 كيلودالتون. جرت عملية الترشيح الهلامي باستعمال هلام Sephacryl 6B للقمة المستردة من خطـوة التبـادل الآيوني وجرى استرداد عدة قمم من العمود وانتخبت قمة واحدة تمثل وزن جزيئي قريب مـن الـوزن الجزيئـي لبروتين الصدمة الحرارية 90 (84 كيلودالتون) هي قمة بوزن 87 كيلودالتون. أعيدت خطوة الترشيح الهلامـي للقمة المنتخبة من الخطوة السابقة وأستخدم هذه المرة هـلام Sephacryl S-200. أكـدت خطـوة الترشـيح الهلامي الثانية وجود قمة بروتينية واحدة منفردة في الأجزاء التي تم جمعها من خطوة الترشيح الهلامي الأولـى، وأن تلك القمة تمتلك وزن جزيئي 83.176 كيلودالتون. جرى التأكد من نقاوة و وزن تلك القمة بالترحيل الكهربائي على هلام الاكريل أمايد المتعدد وبوجود المواد الماسخة للبروتين (SDS) . تم التحقق من هويـة تلـك الجزيئـة البروتينية على إنها Hsp90β الفأري باستعمال فحص التثبيت المناعي بالترحيل الكهربائي على هـلام الأكـاروز1% و بتوظيف عدة تشخيص ذات أضداد قياسية وحيدة النسيلة monoclonal antibody متخصصة للارتباط مع Hsp90β الفأري. -Murine heat shock protein 90 beta isotype (84 kDa) was purified from the cytoplasm of AMN3 cells (locally established mice mammary adenocarcenoma cell line). This protein does not have an in vitro activity assay, to confirm its presence during purification, detection of protein with molecular weight equal or near 84 kDa was followed in each purification step. The cell cytoplasm fraction of AMN3 cells contained proteins of molecular weight (MW) ranged from 23. 4 to 85. 1 kDa as determined with SDS-PAGE analysis. The precipitate of 70% ammonium sulfate saturation of cytoplasm fraction exhibited protein bands with molecular weight ranged from 31. 6 to 93.3 kDa. Ion exchange chromato