An improved method for characterization of the mutation associated to porcine stress syndrome by PCR amplification followed by restriction analysis/Um metodo melhorado para caracterizacao da mutacao associada a sindrome do estresse suino por amplificacao por PCR seguido de analise de restricao

A mutation in the gene coding for the ryanodine receptor 1 (RYR1), also known as halothane (hal) gene or swine stress gene, is associated to the porcine stress syndrome (PSS). Detection of the mutation is normally accomplished by PCR amplification of an 81bp fragment of the hal gene, followed by digestion with the HhaI restriction endonuclease. Wild-type allele (N) is cut in two fragments, whereas the mutant allele (n) is not digested by the restriction enzyme. Electrophoresis of the digested DNA on agarose gel and ethidium bromide staining allows the reading of the result. The correct interpretation is difficult due to the small size of the DNA fragments. In this study we designed a new set of primers for amplification of a 144bp fragment that facilitates the reading of the result. In addition, we optimized the PCR reaction to allow amplification from a single hair bulb, added directly into the PCR mix without previous treatment. This improved method was used to genotype 165 sows and boars used in a breeding program. Forty-nine percent of the animals had the NN genotype, whereas 50% were Nn and only 1% was nn. Key words: PCR-REA, plucked hair, swine stress gene, PSE pork. Uma mutacao no gene que codifica o receptor ryanodine 1 (RYR1), tambem conhecido como gene do halotano (hal) ou gene do estresse suino, esta associada a Sindrome do Estresse Suino (PSS). A mutacao e geralmente detectada por PCR,, a partir da amplificacao de um fragmento de 81pb do gene hal, seguida por digestao com a endonuclease de restricao HhaI. O alelo normal (N) e cortado em dois fragmentos, enquanto que o alelo mutado (n) nao e digerido pela enzima de restricao. A eletroforese do DNA digerido em gel de agarose corado com brometo de etidio permite a leitura do resultado. A interpretacao correta e dificil devido ao pequeno tamanho dos fragmentos. Neste estudo, foi projetado um novo par de iniciadores para a amplificacao de um fragmento de 144pb, o que facilita a leitura do resultado. Adicionalmente, foi otimizada a reacao de PCR para permitir a amplificacao a partir de um unico bulbo capilar, acrescentado diretamente na mistura de PCR, sem tratamento previo. Esse metodo foi usado para genotipar 165 reprodutores utilizados em granjas produtoras de matrizes. Quarenta e nove porcento dos animais apresentaram genotipo NN, 50% Nn e apenas 1% nn. Palavras-chave: PCR-REA, pelo, gene do estresse suino, carne PSE.