DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE VETORES EPISSOMAIS NÃO-TRANSIENTES PARA USO EM TERAPIA GÊNICA NA DOENÇA FALCIFORME

As Doenças Falciformes (DF) são hemoglobinopatias hereditárias que ocasionam dor aguda e danos progressivos em múltiplos órgãos e tecidos do corpo devido à expressão da Hemoglobina S (HbS). A HbS no estado desoxigenado acarreta deformação das hemácias, levando à rigidez da membrana celular. Isto ocasiona complicações como inflamação crônica, bloqueio dos vasos sanguíneos e hemólise intravascular. Atualmente, os tratamentos convencionais envolvem transfusões sanguíneas e o uso de fármacos, como a hidroxiuréia, para induzir a produção de Hemoglobina Fetal (HbF). Uma possibilidade de cura é o transplante de Células-Tronco Hematopoiéticas (CTH), no entanto, essas abordagens apresentam muitas limitações e efeitos colaterais. Este projeto propõe o desenvolvimento de uma terapia gênica com vetores epissomais, incorporando elementos de replicação autônoma do tipo Região de Ancoramento de Matrix, do inglês Scaffold/Matrix Attachment Region (S/MAR), com elementos para o silenciamento gênico do gene BCL11A, um repressor da expressão de γ-globina (formadora da HbF), além da inserção e expressão de uma β-globina modificada (β-SA3), que impede a polimerização da HbS. Essa estratégia visa superar desafios associados aos vetores epissomais convencionais e vetores virais, proporcionando estabilidade e persistência prolongada do material genético de forma segura nas células-alvo, buscando o desenvolvimento de uma terapia eficaz. Para isso, plasmídeos contendo S/MAR estão sendo sintetizados de modo a silenciar o BCL11A, expressar β-SA3 e combinar estas duas estratégias, para posterior transdução via eletroporação em células K562 e células-tronco hematopoiéticas. Estas células serão diferenciadas em eritrócitos e terão amostras coletadas ao longo do processo para análises de proliferação, morfologia, viabilidade, imunofenotipagem, níveis de HbF, além de expressão gênica (qPCR) e proteica (western blot) de reguladores da hematopoiese. Até o momento, um grupo controle, composto por K562 não transduzidas, foram testadas para padronização dos experimentos e métodos de diferenciação. Essas células passaram por diferentes técnicas de avaliação morfológica pelo método cytospin e tiveram seus padrões de proliferação, apoptose, enucleação, diferenciação e expressão de HbF mensurados via citometria de fluxo. Também foram testadas quanto a expressão de diferentes marcadores celulares como o CD105; CD235a; CD71; CD233; CD44; CD49d; CD43; CD146 e CD123. Os resultados morfológicos e de cit