Multiplex Sybr green assay for coronavirus detection using fast real-time RT-PCR

This study was aimed to provide a local database for detection of coronavirus (CoV) species in suspect individual with respiratory tract infections like influenza type A and a tuberculosis using multiplex Sybr green reverse transcriptase real-time PCR (rRT-PCR) technique. A total of 500 samples was collected from individuals suffering from upper and/or lower respiratory tract diseases for testing of 4 CoV species (229E, OC43, NL63, and HKU1). RNA extracted, amplified and subsequent the positive samples sequencing. The results showed melting curve analysis (Tm) of the specific amplicons (79.73 ± 0.36) and 9 % positive for CoVs and some of them have other co-infection such as influenza virus 26.67 % , and TB 11.11 % . On the other hands, the CoVs were detected 4.62 % in upper respiratory samples and 20.39% with lower respiratory samples. Sequencing results pointed out two isolates were CoV-NL63 and four isolates were CoV-229E, with first record accession number MN086823.1 and MN086824.1, respectively in GenBank. In conclusion, this rRT-PCR showed the rapid and efficient detection of CoVs with few copies number. This allows being used for the diagnosis of CoVs along with other respiratory viruses in a multiplex assay to reduce processing time. Subsequent applied nested RT-PCR to overcome the low viral load. هدفت الدراسة إلى توفير قاعدة بيانات محلية للكشف عن أنواع فيروس الكورونا في الاشخاص المصابين بالتهابات الجهاز التنفسي مثل الأنفلونزا و السل باستخدام تقنية تفاعل سلسلة البلمرة العكسي اللحظي لصبغة السايبر الخضراء. (rRT-PCR) جمعت 500 عينة من الأفراد الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي العلوي و السفلي لاختبار أنواع الفيروس و هي 229E، OC43، NL63، HKU1. استخلص الحمض النووي الريبي، ضخمة و بعد ذلك أجرى فحص تسلسل القواعد النيتروجينية للعينات الموجبة. أظهرت النتائج تحليل منحنى الانصهار (Tm) لتضخيم المادة الوراثية الخاصة بالفيروس (79.73 ± 0.36) و كانت 9 ٪ إيجابية CoV و بعضها مصاب بعدوى مشتركة كفيروس الأنفلونزا 26.67 ٪، و السل 11.11 ٪. من ناحية أخرى، تم الكشف عن CoVs % 4.62 في عينات الجهاز التنفسي العلوي و 20.39 ٪ في الجهاز التنفسي السفلي. أشارت النتائج اختبار تتابع القواعد النيتروجينية إلى عزلتين هي CoV-NL63 و أربعة عزلات كانت CoV-229E، و سجلت لأول مرة في بنك الجينات العالمي MN086823.1 و MN086824.1، على التوالي. استنتجت الدراسة، بأن اختبار rRT-PCR هذا هو كشف سريع و فعال بالكشف عن أنواع CoV ذو محتوى فايروسي قليل بالعينة. هذا يسمح باستخدامه لتشخيص الإصابات المصاحبة للفيروسات جنبا إلى جنب مع فيروسات الجهاز التنفسي الأخرى في اختبار متعدد لتقليل وقت التشخيص. تطبيق تقنية ت