A CLOROQUINA REVERTE RESISTÊNCIA E POTENCIALIZA O EFEITO ANTILEUCÊMICO DOS INIBIDORES DE FLT3 EM LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA

A autofagia foi recentemente postulada como um potencial mecanismo que contribui para o desenvolvimento de resistência aos inibidores de FLT3 (FLT3i) em leucemia mieloide aguda (LMA). A cloroquina é um medicamento seguro e de baixo custo e um dos seus efeitos é a inibição da autofagia. Aqui, investigamos o potencial efeito anti-neoplásico da cloroquina (CQ) associada aos FLT3i em modelos de LMA FLT3-ITD. Em modelos de LMA FLT3-ITD (células MOLM13 e MV411), o tratamento com FLT3i (PKC412 e AC220) aumentou significativamente o fluxo autofágico induzindo a formação de organelas vesiculares ácidas, conforme quantificado por citometria de fluxo e confirmado por microscopia de fluorescência, por meio do marcador de autofagia laranja de acridina. Observamos uma redução nos reguladores negativos da autofagia, evidenciada pela inibição da fosforilação em AKT (pSer473), mTOR (pSer2448) e seu alvo a jusante p70S6K (pThr421/Ser424), bem como uma redução em p-ULK1 (pSer757). O tratamento com FLT3i resultou na conversão de LC3B-I em LC3B-II, seguido pela degradação de LC3B-II e p62, indicando indução de autofagia. A combinação de FLT3i com CQ (10 μM) reduziu significativamente a viabilidade e sobrevivência celular. Para investigar se a CQ induziu a morte celular por meio de potenciais efeitos off target e não devido ao bloqueio da autofagia, realizamos um silenciamento induzido por shRNA (KD) do mediador de autofagia ATG5 em células FLT3-ITD. O tratamento com FLT3i em células MOLM13 ATG5-KD reduziu significativamente o IC50 para o PKC412 (ATG5-KD:17nM vs controle:31nM) e aumentou a indução de apoptose. Para investigar se a inibição da autofagia seria uma opção para células resistentes a FLT3i, geramos células MV411 resistentes a AC220 (MV411 QR). Células MV411 QR exibiram um nível basal mais alto de autofagia em comparação com células MV411 convencionais, indicado pelo aumento da formação de organelas vesiculares ácidas e níveis reduzidos de proteína de LC3B e p62. O tratamento com CQ reduziu efetivamente o IC50 para o AC220 (monoterapia:7,68nM vs combinação:5,3nM) e aumentou a morte celular, sugerindo seu uso para mediar a resistência ao FLT3i na LMA. Molecularmente, a análise proteica revelou aumento no efeito do AC220 quando associado com CQ em células MV411 QR, evidenciado pelo aumento de Caspase3 e pela redução de pSTAT5 e pP70S6K. Amostras de células primárias de LMA tratadas ex vivo mostraram que a combinação de FLT3i com CQ reduziu a proliferação e sobrevivência