Rediseño de la eficiencia catalítica y de la termorresistencia de la glucanasa de Bacillus licheniformis

Introducción Las b(l 3)(l 4) glucanasas son enzimas de gran interés biotecnólogico tanto en la industria cervezera como en la de fabricación de piensos. Los objetivos de esta tesis han sido: rediseñar la glucanasa de bacillus licheniformis con objeto de tratar de mejorar la actividad enzimática y determinar la función del lazo mayor del centro activo en dicho proceso, así como analizar y rediseñar la estabilidad térmica del enzima, en particular determinar la influencia del lazo mayor en la desnaturalización térmica, relacionándolo con el proceso y tipo de plegamiento. Análisis de los mutantes de saturación en la posición 58 de glucanasas 1. La reducción de volumen de la cadena lateral aumenta la actividad, aumentado la constante catalítica kcat, si bien disminuye la Km. El mutante M58G presenta la actividad más alta, hasta 6 veces más que el silvestre, y el mutante M58A presenta más de 4 veces la actividad del silvestre, ambos, en términos de kcat/Km. 2. Los residuos hidrófilos disminuyen la actividad. 3. Unicamente en mutantes aromáticos como M58F y M58W, se aprecia una disminución de valores de Km, respecto al enzima silvestre. El análisis de la termorresistencia 1. Con respecto al medio, serían claves el pH (por pérdida de interacciones pH dependientes), el tampón (por su posible papel quelante),y la presencia de sustrato (porque estabilizaría). 2. Con respecto a la estructura serían claves los aminoácidos del lazo y la coordinación del Ca++. La coordinación del Ca++ puede ser mejorada introduciendo una nueva interacción entre el catión y la beta 15, como en el caso del mutante N236D. 3. Finalmente, la termoinactivación de la glucanasa de Bacillus licheniformis, en todos los mutantes estudiados, siguen un patrón bifásico. Su análisis cinético permite justificar el efecto de diversos mutantes y el comportamiento del enzima frente a la temperatura. Introduction The (l-3)(l-4) glucanases are enzymes of great biotechnologyc interest in the brewery industry and in the manufacture of fodder. One objective of this thesis is to redesign the glucanase of bacillus licheniformis trying to improve its enzymatic activity to determine the function that the big loop, situated in the active centre, in this process. Another objective is to analyse and redesign the thermal stability of the enzyme, determining, in particular, the influence of the big loop in the thermal denaturation, and the relation with the process and type of folding. Analysis of the saturation at pos