Optimization of flow cytometry assays for the detection of injured foodborne pathogenic bacteria

Algunos tratamientos de elaboración y conservación de los alimentos lesionan las bacterias, de manera que pierden la capacidad para multiplicarse y no son detectadas por métodos de cultivo convencionales. La citometría de flujo es una técnica de análisis independiente del cultivo de los microorganismos, usada ampliamente para evaluar de manera rápida el estado fisiológico de células bacterianas individuales, siendo la integridad de membrana unos de los indicadores más habituales debido a su importancia en la supervivencia de éstas. Sin embargo, los resultados obtenidos mediante citometría de flujo se ven afectados por la presencia de partículas de las muestras alimentarias. En esta tesis, se evaluaron estrategias para desarrollar un ensayo por citometría de flujo basado en el uso del yoduro de propidio (YP), fluorocromo que no atraviesa las membranas intactas, combinado con un fluorocromo que penetra las membranas intactas, para detectar y cuantificar con precisión bacterias patógenas lesionadas. En el primer experimento, se ajustaron las concentraciones y las ratios de combinaciones de YP con SYTO 9, SYTO 24 y SYTO BC para mejorar la resolución de poblaciones de células sanas y muertas de Escherichia coli O157:H7, Salmonella Enteritidis y Listeria monocytogenes en suspensiones control. Esto permitió detectar células lesionadas en suspensiones expuestas a estreses relacionados con los alimentos. En el segundo experimento, se aplicaron las tinciones optimizadas a muestras de ensalada de pasta inoculadas con E. coli O157:H7. Asimismo, se compararon ocho pre-tratamientos basados en la filtración gruesa de las muestras homogeneizadas y en un paso de dilución/lavado, para evaluar la reducción de partículas interferentes y la recuperación de E. coli O157:H7 de la ensalada. El pre-tratamiento más favorable fue la combinación de la bolsa de homogenización con filtro de 63 µm y la filtración centrífuga a través de un filtro de 5 µm, ya que redujo la concentración de partículas interferentes tanto como diluir la muestra. Considerando que el objetivo principal de esta tesis fue detectar específicamente bacterias patógenas lesionadas, en el tercer experimento, la optimización se llevó a cabo para suspensiones control de E. coli O157:H7 en soluciones tampón comúnmente usadas en inmunoensayos, y teñidas con SYBR Green I, un fluorocromo con alta afinidad por los ácidos nucleicos, YP y un anticuerpo marcado con R-ficoeritrina (Ac-RFE). La adición de Ac-RFE no afectó notab