Toward a New Generation of Glucose Isomerases Through Genetic Engineering

Streptomyces violaceoniger glucose isomerase (GI) was originally developed in 1973 when expectations about the future of HFCS in Europe were great. Improvement of the original strain CBS 409—73 obliged to consider the possible utilizations of genetic engineering as the best possible way for obtaining hyperproduction of the enzyme. The structure gene of GI was cloned and transferred in an integrating plasmid PUT 220 derived from pIJ 702. The sequence of the gene was determined and compared to the aminoacid sequence of the purified glucose isomerase. Crystallization of the enzyme was achieved and its 3‐D structure established; S. volaceoniger GI is normally existing as a tetramer with 4 identical sub‐units of 388AA each. The monomer includes a (alpha‐beta) 8 barrel sub‐structure and a large hydrophobic loop involved in the formation of dimers. Simultaneously, structural analysis of S. olivochromogenes GI revealed a great similitude with S. violaceoniger GI, though the former could exist as a dimer. In view of this situation and considering that because of a high level of homology, both enzymes presented significant differences in their functional properties, hybrid molecules were constructed and site directed mutagenesis utilized to create new GI species with modified properties. Auf dem Wege zu einer neuen Generation von Glucoseisomerasen durch Gentechnologie. Glucoseisomerase (GI) aus Streptomyces violaceoniger wurde zum erstenmal 1973 entwickelt, als die Zukunftsaussichten für hochfructosehaltigen Glucosesirup in Europa gut waren. Nach der Verbesserung des Ausgangsstammes CBS 409—73 mußte die Gentechnologie als bestmöglicher Weg zur großtechnischen Herstellung des Enzyms betrachtet werden. Dann wurde das Strukturgen von GI geklont und in ein integrierendes Plasmid pUT 220 übertragen, das von pIJ 702 gewonnen wurde. Die Gensequenz wurde bestimmt und mit der Aminosäuresequenz der gereinigten Glucoseisomerase verglichen. Das Enzym wurde auskristallisiert und seine dreidimensionale Struktur festgestellt. S. violaceoniger GI existiert normalerweise als Tetramer mit 4 identischen Untereinheiten von je 388AA. Das Monomer enthält eine (Alpha‐Beta) 8 faßförmige Substruktur sowie einen großen hydrophoben Ring, der an der Entstehung der Dimere beteiligt ist. Gleichzeitig zeigte die Strukturanalyse von S. olivochromogenes GI eine große Ähnlichkeit mit S. violaceoniger GI, obgleich S. olivochromogenes GI als Dimer existieren könnte. Angesichts dieser Situation und der