Engineering of Orthogonal Aminoacyl tRNA Synthetase/tRNA Pairs for Codon Reassignment in the Chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii

Mikroalger etablerer seg som en attraktiv produksjonsplatform for rekombinante proteiner og andre biobaserte produkter. Kloroplasten opprettholder sitt eget maskineri for proteinsyntese og et kompakt kromosom, som på enkelt vis kan manipuleres og dermed etablerer organellen som et spennende område innenfor syntetisk biologi. Slike egenskaper gjør kloroplasten til et ideelt mål for kodon omdisponering for å endre eller utvide den genetiske koden via bruk av flere aminosyrer. Inkorporering av slike ikke-kanoniske aminosyrer under proteinsyntese kan både forbedre eksisterende egenskaper eller sørge for tilegning av nye egenskaper. Aminoasyl tRNA syntetase/tRNA parr har tidligere vært benyttet for kodon omdisponering i flere ulike mikroorganismer, men til nå har ikke mikroalgers kloroplast vært et mål. Arbeidet som er presentert i denne avhandlingen etablerer molekylære verktøy for å kunne identifisere og utnytte ortogonale translasjonsystemer for inkorporering av ncAA under proteinsyntese i kloroplasten til mikroalgen Chlamydomonas reinhardtii. Vektorer som inneholder genetisk konstrukt for omdisponering av opal stoppkodon ble konstruert, som er en betingelse for å kunne inkorporere ikke-kanoniske aminosyrer. Gener som koder for pyrrolysyl-tRNA syntetaser fra Methanomethylophilus alvus, Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei ble genetisk kombinert med gener for opal-supressor tRNA. Disse pyrrolysyl-tRNA syntetasene har tidligere blitt optimalisert for affinitet til ikke-kanoniske aminosyrer. Alle vektorene ble konstruert med et aadA gen som sørger for resistans mot spektinomysin. Flankerende sekvenser ble også benyttet for å tilrettelegge for homolog rekombinasjon med kloroplast lokuset psbH. I tillegg ble et gen som koder for fluoriserende mVenus, med ett ekstra opal kodon innsatt, benyttet som rapportørgen.'Start-Stop assembly' ble benyttet for å konstruere funksjonelt arrløse gener. Start og stopp kodoner fungerte som fusjonsområder mellom promoter/5'utranslatert region, kodende sekvens og 3'utranslatert region. Disse vektorene danner en effektiv verktøykasse for å etablere og analysere inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer i proteiner syntetisert i kloroplasten til Chlamydomonas reinhardtii.