Analyse av eksogene og endogene opioide peptider i dry blood spots ved bruk av HPLC-MS

Opioide peptider forekommer både som eksogene- og som endogene peptider. Endogene peptider er kroppens egne peptider som blant annet funger som eget kontrollsystem på smerter, mens eksogene peptider hovedsakelig kommer utenfra i form av matvarer som f.eks. melk/meieriprodukter og hvete. Eksogene peptider har vist seg å kunne kompleksere seg til target makromolekylær slik som endogene peptider gjør. Hensikten med denne oppgaven var å utvikle en analytisk metode basert på LC-MS for utvalgte eksogene og endogene opioide peptider i plasma og fullblod. Peptidblanding bestående av 11 peptider ble analysert, hvor noen bestemte peptider ble videre analysert basert på deres fysikalsk og kjemiske egenskaper og deres opphav. Eksogene peptider som kasomorfiner (beta-kasomorfin-3, beta-kasomorfin-4 amid og beta-kasomorfin-7), gluteneksorfiner (gliadorfin-7 og gluteneksorfin-C) og en endogen peptid (met-enkefalin-arg-phe) ble dermed valgt for å studere videre. Målet i denne oppgaven var delt i 2 deler: 1. Utvikle og optimalisere en eksisterende LC-MS metoden slik at vi kunne detektere lavest mulig konsentrasjon av peptider. Lave deteksjongrenser er en forutsetning for å kunne studere peptider i "dried blood spots" (DBS). 2. Avsette blod med tilsatt peptidblanding som DBS på kommersielle prøvekort (Whatman 903TM Specimen Collection Paper) og se om vi kunne ekstrahere peptider og detektere dem ved bruk av LC-MS. Videre skulle det studeres i hvilken grad peptidene stabiliseres ved adsorpsjon på prøvekortet, og om det eventuelt var behov for tilsetting av peptidasehemmere som sitronsyre. Tidligere metoder for ekstraksjon av peptider som standardproteinfelling og proteinfelling ved brønnplater ble bruk som refferanser for å sammenlikne ekstaksjonsuttbytte og ekstrajsonsprofil i forhold til dry blood spot metode. Under metodeutvikling ble det utviklet og optimalisert metoder for både prøveopparbeidelse, HPLC og «Time-of Flight»-massespektrometri. Under HPLC metodeutviklingen ble 2 typer seperasjonskolonner testet ut for å se hvilke kolonner som ga best seperasjon og deteksjon av analyttene. C8-kolonnen viste seg å gi best seperasjon og deteksjon av analyttene. Mobilfase som ble kjørt i kolonnene var ultra rent vann og acetonitril der begge var tilsatt 0,1% maursyre, hvor gradienteluering ble benyttet. Under MS-metodeutvikling ble 4 parametere ved elektrosprayionisasjon testet for optimalisering: Kappegasstemperatur ("Sheat gas"), kappegasshastighet, nebulizer trykk og kapillæ