Utvikling av LC-MS- og LC-MS/MS-metoder for analyse av fosfolipider i melk

Melk er den første næringen pattedyr får, og inneholder viktige næringsstoffer som proteiner, fett og laktose. Mesteparten av fettet finnes som små kuler i melken, og membranen til disse kulene sørger for at fettet er delvis emulgert. En viktig komponent i membranen er fosfolipider, og innholdet av fosfolipider i melk har blitt undersøkt mange ganger tidligere med ulike teknikker. I denne oppgaven ble LC-MS- og LC-MS/MS-metoder for analyse av 42 forskjellige fosfolipider fra fire forskjellige fosfolipidklasser i melk utviklet. Det ble etablert en rask metode for prøveopparbeidelse der melkelipidene ekstraheres med en løsning av kloroform og metanol (2:1, v/v). Fosfolipidene ble separert på en HILIC-kolonne med 5 mM vandig ammoniumacetat (A) og acetonitril med 0,1% eddiksyre (B) som mobilfaser. Det ble brukt en lineær mobilfasegradient med økning fra 2-21% A i løpet av 40 minutter. Forut for LC-MS-analysene av melk ble en allerede etablert offline SPE-GC-MS-metode benyttet for å innhente fettsyreprofilen til de polare lipidene. Analysen viste at de mest dominerende fettsyrene var C16:0, C18:1n-9, C18:0 og C18:2n-6. De mettede fettsyrene utgjorde 61,2%, de enumettede 32,9% og de flerumettede 5,9%. Informasjonen ble brukt som støtte ved identifikasjon av fosfolipidforbindelser etter LC-MS-analyse. Valideringen av metoden viste en matrikseffekt for de fire klassene ved 0,5 µg/mL fosfolipid på mellom 120 og 170% og 80,6 og 93,8% ved 100 µg/mL fosfolipid. Presisjonen til metoden hadde RSD under 6,5%, og carry-over ble kun observert for PC og LPC med verdier under LOQ. Interdag-variasjonen viste for melkeprøver RSD under 6,5% ved 50 og 100 µg/mL tilsatt standard. For å oppnå mindre matrikseffekt bør prøvevolumet økes. Fosfolipidene ble detektert av en ionefelle i positiv modus, og den lave oppløsningen gjorde det nødvendig å benytte MS/MS til sikker identifikasjon. Det ble brukt multi-SIM-metoder med m/z-verdiene til alle ionene i analysene, og deteksjonsgrensen var 0,2 µg/mL for PC, 0,05 µg/mL for PE og 0,5 µg/mL for SM og LPC. Av de 42 fosfolipidene som ble identifisert var 67% av totalkonsentrasjonen PC, 30% SM, 1,6% PE og 0,93% LPC. De store konsentrasjonsforskjellene mellom PC, SM og PE var ikke forventet. De mest forekommende fosfolipidene var PC C16:0/C20:4, PC C16:0/C18:1, PC C16:1/C18:2 og SM C18:0/C20:0.