Termodynamiske signaturer for substratbinding til cellulaser fra Thermobifida fusca

Denne oppgaven er skrevet som en del av et større forskningsprosjekt der det overordnede målet er å tilegne seg kunnskap om enzymer som katalyserer hydrolyse av de krystallinske substratene cellulose og kitin. Cellulose er den vanligste biopolymeren i naturen og består av β (14) linkede ᴅ-glukoseenheter. Thermobifida fusca er en filamentøs jordbakterie og en viktig nedbryter av organisk materiale. T.fusca syntetiserer en rekke ekstracellulære cellulaser som katalyserer nedbrytning av cellulose, hvorav tre er undersøkt nærmere i denne oppgaven. TfCel5A er en ikke-prosessiv endoaktiv cellulase, TfCel9A er prosessiv og endoaktiv og TfCel48A er prosessiv og eksoaktiv fra den reduserende enden. De termodynamiske signaturene for binding av (Glc)6 til inaktive mutanter av TfCel5A, TfCel9A og TfCel48A har blitt bestemt ved hjelp av isoterm titreringskalorimetri (ITC). Ved 30 °C og pH 6,0 er endringen i bindingsfrienergi lik for de prosessive cellulasene TfCel9A og TfCel48A (hhv. ΔGr° = −8,7 kcal/mol ± 0,2 / −8,6 ± 0,2 kcal/mol). For TfCel5A er endringen i bindingsfrienergi mindre gunstig (ΔGr° = −6,4 ± 0,1 kcal/mol). I TfCel9A og TfCel48A er bindingen drevet av gunstig endring i både entalpi (ΔHr° = −1,1 ±0,1 kcal/mol for TfCel9A og ΔHr° = −2,7 ± 0,3 kcal/mol for TfCel48A) og entropi (−TΔSr° = −7,6 ± 0,2 kcal/mol for TfCel9A og −TΔSr° = −5,9 ± 0,4 kcal/mol for TfCel48A). Binding av (Glc)6 til TfCel5A er kun entalpisk drevet ved 30 °C (ΔHr° = − 6,4 ± 0,2 kcal/mol, −TΔSr° = 0,0 ± 0,2 kcal/mol). Endringen i varmekapasitet, ΔCp,r°, er 209 ±17 cal/K·mol, 239 ± 21 cal/K·mol og 176 ± 25 cal/K·mol for henholdsvis TfCel5A, TfCel9A og TfCel48A. Det foreligger en hypotese som direkte kobler bindingsfrienergi (ΔGr°) og iboende prosessivitet (PIntr). De eksperimentelt bestemte ΔGr° fra denne oppgaven har derfor blitt sammenlignet med tidligere publiserte prosessivitetsverdier for TfCel5A, TfCel9A og TfCel48A. Resultatene indikerer at det er en kvalitativ sammenheng mellom bindingsfrienergi og prosessivitet. I tillegg til ITC-forsøk har det blitt utført hydrolyse av cello-oligosakkarider ((Glc)x) i H218O med aktive enzymer, for å undersøke posisjoneringen av substratet i det aktive setet. Resultatene fra hydrolyse av (Glc)5 i H218O viser at binding i subsete −3  +2 dominerer i TfCel48A, med en dimer i de to produktbindende subsetene +1 og +2. Den endoaktive TfCel5A hadde samme posisjonering av substratet. I TfCel9A dominerer binding −4  +1 ved hydrolyse av (Glc)5, der de neg