铜绿假单胞菌重组Bb-pGEX-OprI疫苗的构建及其保护力的研究

目的构建并鉴定含有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）外膜蛋白I（OprI）基因与两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum，Bb）疫苗（Bb-pGEX—OprI），并研究该疫苗对小鼠Pa感染的保护作用。方法PCR扩增OprI抗原编码基因并将其定向克隆至pGEX-1λT，构建重组质粒pGEX-OprI，将pGEX-OprI电穿孔转化Bb，构建Bb-pGEX-OprI疫苗，进行双酶切、PCR和测序鉴定后，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，SDS-PAGE和Westernblot分别分析并鉴定表达产物。21只小鼠随机分为3组，分别灌胃接种Bb-pGEX-OprI疫苗、空载体疫苗（Bb-pGEX-1λT）和Bb。首次免疫后4周用PA01株攻击。攻击后2周处死小鼠取肺组织，计数肺组织的细菌菌落数。免疫前、首次免疫后4周和PA01株攻击后2周采小鼠静脉血，常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE。结果PCR成功扩增出194bp的OprI抗原编码基因；双酶切、PCR和测序证实OprI基因成功克隆入pGEX—1λT中，并且pGEX-OprI成功转化Bb，构建为Bb—pGEX-OprI疫苗；SDS-PAGE显示Bb—pGEX-OprI表达相对分子质量约32×10^3的OprI-谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白；Western blot证实融合蛋白能被Pa感染的鼠血清特异性识别。Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠肺组织的细菌菌落数低于Bb-pGEX—1λT组和Bb组（P〈0．01），Bb—pGEX-OprI疫苗组小鼠血清IgG、IgG2b、IgG3和IgE水平在首次免疫后4周和攻击后2周依次升高，相同时间点Bb—pGEX—OprI疫苗组小鼠血清抗体水平均高于Bb-pGEX-1λT和Bb组（P〈0．01或P〈0．05）。结论成功构建了重组疫苗Bb—pGEX-OprI，其在小鼠抗Pa感染过程中可产生有效的体液免疫应答。