基于转录组分析苹果水杨酸特异响应基因MdWRKY40的启动子鉴定

[目的]探明水杨酸（SA）对苹果叶片基因转录调控的影响,鉴定SA信号途径及其调控基因,为研究SA介导的抗病分子机制提供理论依据。[方法]生长30 d的‘嘎啦’组培苗叶片用2 mmol·L-1水杨酸（SA）处理12 h,以CTRL（0.2%乙醇）处理作为对照,利用Illumina Hi Seq TM 2000进行转录组测序,通过综合的生物信息学分析（差异基因筛选、条件特异性分析、GO分类及KEGG富集分析等）筛选SA信号途径的调控基因。克隆受SA特异性诱导表达基因的启动子,利用苹果细胞原生质体转化技术,进行启动子活性鉴定,确定对SA进行特异性响应的核苷酸序列。[结果]CTRL和SA处理分别获得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始数据,分别有44.77%和43.88%与‘金冠’苹果基因组完全匹配。获得3 329个显著性差异基因,包括苯丙烷类、类黄酮等次生代谢物生物合成途径的相关基因（如木质素合成关键酶CAD、细胞色素P450、真菌抗性相关的β-1,3-葡聚糖酶等）,调控植物病原菌互作途径重要功能基因（钙调蛋白Ca M、抗病蛋白RPM1、热激蛋白HSP90、WRKY转录因子等）以及33个条件特异性诱导表达基因（NAC转录因子、NIMIN1、WRKY40、ERF转录因子等）。其中1 085个基因上调,2 244个基因下调。差异基因主要涉及细胞过程、代谢过程和基因绑定、催化活性等;根据转录组学的结果,将SA响应基因Md WRKY40的启动子序列克隆到含有荧光素酶基因的表达载体中,置于荧光素酶基因的上游,转化苹果原生质体细胞。SA处理的原生质体细胞,荧光素酶的活性为未经SA处理的20.6倍,而脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、1-氨基环丙烷羧酸（ACC）对荧光素酶的活性没有影响,说明该启动子为苹果中对SA进行特异性响应的启动子序列。不同区段的启动子片段对SA响应能力不同,从Md WRKY40翻译起始位点ATG向上游500—1 000 bp只能响应高浓度SA,而对低浓度SA不具有响应能力,1 500 bp片段对高浓度SA响应能力进一步显著增强,对低浓度SA响应也有微弱提高;而长度为2 000 bp的核苷酸片段无论对高浓度SA还是对低浓度SA都具有显著响应能力,且达到最强。与2 000 bp片段相比,2 500 bp的核苷酸片段没有进一步增强启动子片段对SA的响应能力。超表达Md WRKY40蛋白对其