基于线粒体DNA-COI序列的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测

【目的】设计禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）和菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）特异性引物,建立同步快速检测这两种线虫的双重PCR体系,为中国小麦孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析10种植物寄生线虫24个群体的线粒体DNA（mtDNA）COI序列,分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物Ha F8和Hf F9,以及下游通用引物Haf R8;通过引物浓度比和退火温度的优化,建立针对这两种CCN的双重PCR检测体系;利用该体系对中国黄淮麦区部分CCN样品进行种类鉴定。【结果】筛选并获得的特异性引物Ha F8/Haf R8及Hf F9/Haf R8,可在一步PCR反应中实现对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性检测。引物Ha F8/Haf R8对禾谷孢囊线虫的特异性扩增产物为200 bp,而Hf F9/Haf R8对菲利普孢囊线虫的特异性扩增产物为320 bp,条带区分较明显。对双重PCR检测体系的优化发现,引物Ha F8、Hf F9、Haf R8的退火温度为58℃时,该检测体系具有较高的特异性和扩增效率;引物Ha F8﹕Hf F9﹕Haf R8浓度比为0.24﹕0.16﹕0.4μmol·L-1时,该检测体系能从不同供试线虫中同时特异性地检测出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫,且扩增效率较高。该检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单孢囊的检测灵敏度为1/2 000 000个孢囊,而对2龄幼虫的检测灵敏度则分别为1/640条线虫和1/1 280条线虫。对采集自中国黄淮麦区CCN病田的14份土样进行双重PCR检测,发现有8个样本只扩增出200 bp的条带,表明这些样本的CCN种类为禾谷孢囊线虫,有4个样本只扩增出320 bp的条带,表明CCN种类为菲利普孢囊线虫,2个样本同时扩增出200和320 bp两个条带,表明样品为禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的混合发生。以上结果表明,该检测体系可以成功用于两种小麦孢囊线虫田间复合侵染情况的快速诊断。【结论】基于mtDNA-COI序列开发的特异性引物以及建立的双重PCR检测体系,可用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫田间单一和混合发生样本的同步快速检测。