FABP4转基因牛的分子生物学鉴定

目的对前期获得的3头转基因牛进行分子生物学评价，包括转基因阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测，旨在进一步为转基因牛的安全评价提供一些科学依据。方法根据 GenBank 上公布的牛 FABP4基因（GenBank登录号：NM_174314）mRNA序列，利用兼并密码子对现有FABP4基因进行突变，并构建了pEGFP-C1-FABP4真核表达载体、通过细胞转染、体细胞核移植、胚胎移植技术获得3头转基因牛；分别采集了1号转基因牛不同组织样，2、3号转基因牛与野生型个体8、10、12、14月龄的血液样本，利用RT-PCR技术对所获转基因个体的阳性与否进行了鉴定；同时利用荧光定量PCR技术检测了1号转基因牛不同组织中外源性FABP4基因的表达情况，并分析了2、3号转基因牛在8—14月龄之间，外源性FABP4基因、内源性FABP4基因的变化趋势，并通过叠加转基因牛外源与内源性FABP4基因的表达量，分析了转基因牛和非转基因牛FABP4基因的整体表达水平差异；通过Western blotting技术分析了3头转基因牛外源性FABP4基因的蛋白表达水平。结果①对所获得的3头转基因牛RT-PCR检测发现，3头转基因个体各样本均在205 bp处产生条带，而妊娠母牛及阴性对照在205 bp处均未有条带出现，初步表明3头转基因牛均为转基因阳性。②实时定量 PCR 检测表明，1号转基因牛的外源性 FABP4基因在多数组织均有较高表达，其中脂肪组织表达量最高、肾脏和背最长肌次之，肺部的相对表达量极低。3号转基因牛外源性FABP4基因的表达水平高于2号转基因牛，且2、3号转基因牛外源性FABP4基因的表达水平随月龄变化均呈现先上升后下降趋势；在内源性FABP4基因表达水平检测中发现，外源性FABP4基因的转入抑制了转基因牛体内内源性FABP4基因的表达，且随月龄变化转基因牛体内内源性FABP4基因表达水平均呈现上升趋势；野生型牛内源性FABP4基因的表达水平随着月龄变化逐步下降，而转基因牛体内内源性FABP4基因的表达量均低于野生型牛；通过对2、3号转基因牛外源与内源性 FABP4基因相对表达量的叠加分析发现，转基因牛FABP4基因整体表达量较野生型大幅升高。③蛋白表达检测结果与mRNA检测结果基本一致，外源性FABP4基因在1号转基因牛除肺部外的各个组织均检测到外源FABP4基因的蛋白表达，其中背最长肌表达量最高；3号转基因牛蛋白表达水平高