shRNA转基因猪中miRNA通路饱和引起的早期致死性

研究目的：通过制备抗猪瘟病毒shRNA转基因猪，探索shRNA对猪胎儿成纤维细胞、克隆猪早期胚胎发育以及转基因猪的影响。创新要点：基于稳定表达shRNA的猪胎儿成纤维克隆细胞及shRNA转基因克隆猪制备的结果，发现shRNA对克隆猪早期囊胚发育阶段无明显毒性，并首次报道了在shRNA转基因动物中，shRNA引起体内miRNA通路过饱和及动物致死性等毒性。研究方法：实验构建了多种抗猪瘟病毒shRNA表达载体，转染猪胎儿成纤维细胞并筛选得到细胞克隆，结合体细胞核移植技术制备了shRNA转基因猪。使用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）检测了细胞及个体水平siRNA的表达量、干扰素反应相关基因、内源miRNA及通路因子的表达量，同时检测了shRNA克隆细胞囊胚率。重要结论：shRNA能有效抑制猪瘟病毒的复制。在猪胎儿成纤维细胞水平上，稳定表达shRNA能引起细胞内干扰素反应、miRNA通路过饱和等副作用；在克隆猪发育阶段，shRNA对克隆猪早期囊胚发育阶段无明显毒性；在shRNA转基因克隆猪个体水平上，shRNA引起克隆猪体内miRNA通路过饱和及克隆猪早期易致死等毒性。