巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

【目的】建立nested—PCR方法，快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax8 Vellaesubsp．citrulli，Aac），为西瓜细菌性果斑病（bacterialfruitblotchofwatermelon，WFB）的防控提供技术支持。【方法】根据AacBOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1／BX-R5和BX-L1／Bx—S-R2，建立以Bx—L1／Bx—R5为外侧引物，Bx—L1／Bx—s—R2为内侧引物的nested-PeR，以5uL样品处理液于99℃高温裂解10min，再放置冰上冷却5min，以所释放病原洲A为模板进行PCR扩增，采用50μL反应体系：5μL10×PCRbuffer（25mm01．L。MgCl2），4-1LdNTP（D4030RA，2．5mmol·L-1），5J物（5μmol·L-1）各3μL，0．4uLTaqDNA酶（DR001B，5U·μL-1），通过退火温度优化，反应条件为：引物BX-L1／BX-R5各3“L进行第一轮扩增，95℃，2min；95℃，30s；65℃，45s；72℃，1rain；35个循环；72℃，延伸7rain；取扩增后的产物1gL为模板，以引物BX-L1／sx—s—R2各3gL进行第二轮扩增，95℃，2rain；95℃，30s，66℃，45s，72℃，1min，30个循环，72℃，7min。在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验，对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测。【结果】引物Bx—L1／BX-R5和BX-L1／BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段，并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特菜兰亚种（A．avenaesubsp．cattleyae）、魔芋假单胞菌（A．aVellaesubspkonjaF，）及其不相关菌株未扩增出目标片段。以Bx—L1／BX-R5为外侧引物，BX-L1／BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR，对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4．7×10 1cfu／mL，比direct-PCR灵敏度高出1000倍。当西瓜种子带菌率在0．1％一0．5％时，nested-PCR阳性检测率为66．7％；当种子带菌率为1％--10％时，nested—PCR的阳性检测率为83％-100％。【结论】以Bx—L1／BX-R5为外侧BI物，BX-L1