血清病毒检出核苷（酸）类似物耐药突变的慢性乙肝患者PBMCs中HBV cccDNA基因突变特点分析

目的分析经核苷（酸）类似物治疗并已在血清病毒中产生耐药基因突变的慢性乙肝患者外周血单个核细胞（PBMCs）中HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）反转录酶（RT）区的基因突变特点。方法收集2010年7月-2011年8月于解放军302医院住院的慢性乙肝患者30例,均经6个月以上的核苷（酸）类似物抗病毒治疗并已在血清中检测到耐药相关突变。采集与血清检测同一时间点的全血标本30份并分离PBMCs,提取总DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶（PSAD）消化＋滚环扩增＋跨缺口PCR方法扩增HBV cccDNA的RT区,分析9个位点的核苷（酸）类似物耐药相关变异。结果 30份样本中,16例检出HBV cccDNA,检出率为53.3%,PBMCs中HBV cccDNA检出率与HBeAg阳性率、血清ALT水平及血清HBVDNA载量均无显著相关性。在16例HBV cccDNA检出者中,B基因型5例,占31.3%,C基因型11例,占68.8%,与血清HBV基因分型结果一致。但是,与血清HBV均检出耐药突变株不同,16例PBMCs cccDNA中检出的病毒均是无核苷（酸）类似物耐药相关突变的野生株。结论在经核苷（酸）类似物治疗的慢性乙肝患者血清中HBV DNA产生耐药突变的情况下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,推测PBMCs可能是体内HBV野生株的＂存储库＂。