重组大鼠谷氨酸脱羧酶载体的构建和功能分析

目的谷氨酸脱羧酶2 （glutamic acid decarboxylase 2,GAD65） 是γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）的合成酶。本研究拟构建重组大鼠GAD65基因的慢病毒载体（recombinant lentivirus-rGAD65,rLV-rGAD65）,并在体内外分析其功能。方法用RT-PCR法克隆大鼠GAD65基因的cDNA 并亚克隆至慢病毒载体上,形成重组慢病毒质粒（rLV-GFP-rGAD65）。在包装质粒的帮助下,获得重组慢病毒颗粒（rLV-rGAD65）并检测其滴度。用rLV-rGAD65感染原代培养的大鼠肺成纤维细胞,并用免疫细胞化学和蛋白印迹法检测rGAD65在成纤维细胞中的表达,用高效液相法（high-performance liquid chromatograph, HPLC）检测培养上清中GABA的含量。在体内, rLV-rGAD65 定点注射到Sprague-Dawley大鼠的丘脑底核（subthalamic nucleus,STN）。用免疫组织化学和蛋白印迹法检测GAD65基因在STN中的表达水平,HPLC检测黑质网状部（substantia nigra pars reticulata,SNr） 中GABA的含量。结果 rGAD65 的序列与GenBank几乎一致,没有碱基的突变。rLV-rGAD65的滴度达6.8 × 108/mL。在体外,rLV-rGAD65对成纤维细胞的感染效率可达80%,而对照组中几乎没有GAD65蛋白的表达。在上清液中,GABA的含量达到了（48.14 ± 9.35） nmol/L。在体内, rGAD65与绿色荧光蛋白共表达于注射侧的STN区,GAD65蛋白的含量明显高于对照组和注射的对侧。GABA在SNr 中的含量也从（5.95 ± 1.09） 升高到（12.44 ± 3.79） nmol/g。结论重组GAD65载体构建成功。在体外,重组慢病毒颗粒可以感染原代培养的成纤维细胞,并能催化GABA的合成。在体内,重组慢病毒颗粒可以感染STN的神经元并能使SNr中GABA的含量增加。