棉铃虫中肠cDNA文库的构建及EST分析

中肠是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）发挥作用的主要部位,中肠上很多蛋白被认为是Bt毒素的结合蛋白。为了探索棉铃虫Helicoverpa armigera对Bt的抗性机制,我们运用RNA转录过程中的5＇末端转换机制（Switching Mechanism at5＇end of the RNA Transcript,SMART）技术构建了棉铃虫中肠的cDNA文库。先提取棉铃虫5龄幼虫中肠组织的总RNA,合成双链cDNA,经过均一化处理后,酶切、连接载体、转化到大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞,最后进行滴度测试、文库扩增并进行EST序列测定。对该文库质量分析表明：文库滴度为2×106pfu/mL,重组率为100%,平均插入片段大于1kb,全长率为50%。最终成功得到1098条表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）序列,经Phrap程序聚类拼接后得到789条单基因簇（unigene）,包括132个重叠群（congtigs）和657个单拷贝（singlets）。将聚类拼接后的789条ESTs序列在NT,NR和SWISSPORT库中进行本地化搜索,比对后发现：218条序列（27.62%）没有注解;119条序列（15.08%）注解不明确;452条序列（57.29%）有功能注解,并表达300多种基因产物。构建的文库各项指标均达到要求,该文库的构建为棉铃虫中肠各类基因的克隆及功能分析奠定了基础。