凍結保存およびガラス化保存されためん羊胚の生存性と直接移植による受胎性

凍結保存およびガラス化保存されためん羊胚の生存性と直接移植による受胎性 岡田亜紀・吉井久美子・水落康友・安藤俊雄・丞々幸生・和知祥子・外川守彦・石田直久・浅田正嗣・福井豊 帯広畜産大学・家畜育種増殖学講座 近年、高価な機器を必要とせず短時間で行えるガラス化保存法が注目されてきている。また、ウシを中心に行われているダイレクト移植法は野外に適した移植法である。本研究では、緩慢凍結法(ethylene glycol (EG)-3 step法)、ダイレクト移植用凍結法(ダイレクト法)およびガラス化法で凍結保存しためん羊胚を融解後培養に供してその生存性を比較検討し(実験1)、ダイレクト法で凍結保存した胚をステップワイズ移植(s-ET)またはダイレクト移植(d-ET)に供して移植法の検討を行い、またガラス化保存胚によるs-ET試験を実施した(実験2)。生体内由来めん羊胚(桑実胚から胚盤胞期胚)を以下の3方法で凍結保存した。EG-3 step法:1.5M EG溶液に平衡させ緩慢冷却した後液体窒素(LN2)中に保存した。ダイレクト法:4%EGと4% propylene glycolを含む凍結溶液に平衡後、0.3M sucrose溶液を両脇に配してストローに吸引した後緩慢凍結した。ガラス化法:3段階で25% glycerol(GLY)と25% EGを含むガラス化溶液に移してから30秒以内にLN2中に投入した。実験1.融解後の胚は全て耐凍剤を希釈・除去後mSOFaaciで培養した。生存率、孵化率(～144h)、正常孵化率(～72h)において各保存法間、各発育段階間に有意差は見られなかった。EG-3 step法の生存率は他の方法よりも高い傾向がみられたが生存胚に孵化遅延や変性が多く(28.6%;ダイレクト法:16.7%、ガラス化法:6.7%)、孵化率に有意差は見られなかった。実験2.ダイレクト法により凍結保存した胚を融解後に各方法で胚移植した。受胎率、分娩率は共に25%であったが、d-ET後の生存性はs-ETよりも良いように思われた(移植胚の生存率;18.8% vs.10.0%、融解胚の利用効率;18.8% vs.3.7%)。ガラス化胚の移植試験では形態的に正常な加温胚の69.0%(20/29)を移植に供した所、移植胚の生存性は高く、62.5%(5/8頭)の分娩率が得られた。以上のことより、めん羊にもダイレクト移植法の応用が可能であり、ガラス化法はその後の発育能に悪影響の少ない良好な保存法であることが示唆された。