Plk1 mitotic phosphorylation in the N-terminal region of the BRCA2 protein : identification, characterization and role in protein interactions

BRCA2 est une oncoprotéine fréquemment mutée dans les cancers du sein héréditaires. Pour améliorer le diagnostic de ces cancers, plusieurs études moléculaires ont localisées des régions clés de BRCA2 et ont caractérisées l’impact de mutations sur les fonctions portées par ces régions. Ici, je m’intéresse à la région aa 48 à aa 284 (BRCA2₄₈₋₂₈₄) de la protéine. Cette région conservée est désordonnée (Julien et al. 2020 Biomol. NMR Assign), c.à.d. qu’elle ne contient pas de structure secondaire stable. Cette région est également phosphorylée par la kinase Plk1 à l’entrée en mitose. Cependant, des études précédentes utilisant la spectrométrie de masse n’ont pas permis d’identifier précisément les sites phosphorylés, limitant ainsi leur caractérisation fonctionnelle. Pour contourner ce problème, nous avons utilisé la RMN en temps réel pour identifier et caractériser les phosphorylations de BRCA2₄₈₋₂₈₄, à l’échelle du résidu. Nous avons développé deux protocoles permettant d’étudier la phosphorylation de régions désordonnées pour une grande gamme de pH et températures (Julien et al. 2020 Methods Mol. Biol; Alik et al. 2020 Angew. Chem.). Ainsi, nous avons identifié que Plk1 phosphoryle BRCA2₄₈₋₂₈₄ sur deux sites conservés : pS193 et pT207. Ceci. Nous a servi de base pour la caractérisation de ces sites. D’abord, nous avons identifié grâce à des méthodes biophysiques que BRCA2pT207 est un site d’interaction pour le domaine régulateur de Plk1. En collaboration avec l’équipe de Dr. Aura Carreira, nous avons montré que cette interaction est à la base d’un complexe quaternaire (BRCA2, Plk1, BubR1 et PP2A) qui régule l’alignement des chromosomes en métaphase (Ehlen et al. 2020. Nat Commun.). Nous avons aussi démontré que des mutations de BRCA2 issues de patientes ont un impact sur la phosphorylation de BRCA2 et la formation du complexe. Puis, nous avons réalisé des expériences de protéomique pour identifier de nouveau partenaires mitotiques reconnaissant pBRCA2₄₈₋₂₈₄. Nous avons identifié Plk1 et d’autres protéines impliquées dans la mitose. J’ai débuté l’analyse structurale de deux nouveaux partenaires prometteurs: Kif2C et Chk2. Nous avons aussi étudié le rôle de la préphosphorylation de BRCA2T77 par Cdk sur la phosphorylation par Plk1. Nous avons trouvé que BRCA2pT77 favorisait la phosphorylation de BRCA2S193 par Plk1. Enfin, nous avons initié une étude structurale sur la kinase Plk1, surexprimée dans de nombreux cancers dont le cancer du sein. Ici, j’ai produit p