The three-component multidrug MFS-type efflux pump EmrAB-TolC from Escherichia coli : from cloning to structural analysis

A l’heure actuelle, suite à une mauvaise utilisation des antibiotiques, nous faisons face à un problème majeur de santé publique. En effet la résistance aux antibiotiques de certaines souches bactériennes rend le traitement des infections très complexe. Dans ce contexte, le présent projet de thèse concerne l'étude d'un complexe d'efflux bactérien capable de transporter des antibiotiques du cytoplasme vers l'extérieur de la cellule. Ce complexe est composé d'un transporteur de la membrane interne appartenant à la Major Facilitator Superfamily (MFS) (EmrB, E. coli multidrug resistance), d'un canal de la membrane externe TolC (Tolerance to Colicin E1) et d'un adaptateur périplasmique (EmrA, E. coli multidrug resistance). Contrairement aux systèmes d'efflux de type RND (tels que AcrAB-TolC), peu de choses sont connues sur le système EmrAB-TolC de type MFS. Il est donc important d'étudier l'ensemble du complexe sur le plan structurale et fonctionnel afin d'identifier les différences entre ces deux types de systèmes d’efflux. L'objectif de mon projet de thèse était d'étudier au moins un complexe EmrAB-TolC d'un point de vue structurale. Ainsi durant mes études, le but était d'isoler le complexe directement des bactéries surexprimant les trois partenaires protéiques. Dans un premier temps, 15 systèmes homologues EmrAB-TolC ont été identifiés et leurs gènes correspondants amplifiés à partir de l'ADN génomique de différentes bactéries à Gram négatif. Parmi les gènes des 15 systèmes, les gènes codant pour les systèmes d’E. coli et de V. cholerae ont été étudiés plus en détail. Les vecteurs d'expression codaient pour des marqueurs fluorescents pour la mesure des niveaux d'expression de différentes protéines et pour l'étude de la formation des complexes. Dans un premier temps, les différents niveaux d'expression des protéines (EmrB-mRFP1 et EmrA-sfGFP) ont été étudiés pour plusieurs souches d'expression d'E. coli en mesurant les niveaux de fluorescence rouge et verte et par Western blot (anti-His, Myc et Strep pour EmrB, EmrA et TolC). La souche d'E. coli C41(DE3) était la mieux adaptée pour la co-expression d’EmrAB-TolC. Dans un deuxième temps, la méthodologie FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) a été utilisée pour identifier un complexe adapté à l'étude structurale. Ainsi, cette méthode a permis d'observer que le complexe EmrAB-TolC d'E. coli était produit en plus grande quantité que celui de V. cholerae. Le protocole final de co-purification