Construction d’un châssis bactérien viable, minimal et non pathogène grâce aux outils de biologie de synthèse
Un des objectifs de la biologie de synthèse est de concevoir et produire des organismes « à façon », pour des applications thérapeutiques et industrielles. Une des voies envisagées pour atteindre cet objectif repose sur des techniques de synthèse et de transplantation de génomes entiers, afin de cré...
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| description | Un des objectifs de la biologie de synthèse est de concevoir et produire des organismes « à façon », pour des applications thérapeutiques et industrielles. Une des voies envisagées pour atteindre cet objectif repose sur des techniques de synthèse et de transplantation de génomes entiers, afin de créer des organismes mutants.Le but de cette thèse est de développer des outils de biologie de synthèse qui permettront de construire une cellule minimale et non pathogène, à partir de Mycoplasma pneumoniae. Cette bactérie est l'un des plus petits organismes vivants, avec une taille inférieure au micron et un génome de 816 kpb. Ce mycoplasme est l’un des plus étudiés, avec une collection de données génétiques et multi-« omiques » disponibles. Ces caractéristiques font de cette cellule naturellement « quasi minimale » un point de départ idéal pour la construction d’un châssis bactérien. Néanmoins, la manipulation génétique de ce mycoplasme est difficile, en raison du nombre restreint d'outils disponibles.Une approche récemment développée propose de contourner ces limitations en utilisant la levure Saccharomyces cerevisiae comme plateforme d’ingénierie du génome de M. pneumoniae. L’étape préliminaire à cette approche consiste à cloner le génome bactérien dans la levure. Pour ce faire, une cassette « éléments levure » est insérée dans le génome de M. pneumoniae, pour permettre son maintien comme chromosome artificiel. Les travaux menés au cours de cette thèse ont permis d’insérer cette cassette par le biais d’un transposon, et de cloner ce génome marqué dans la levure. La stabilité du génome cloné a ensuite été étudiée, mettant en évidence que le chromosome bactérien est maintenu durant une dizaine de passages. Nous avons ensuite développé une nouvelle stratégie d’insertion des « éléments levure » en utilisant le système CRISPR/Cas9 pour cloner et éditer simultanément un génome de mycoplasme chez la levure : le CReasPy-Cloning. Cette méthode a été utilisée pour supprimer trois loci différents contenant des gènes impliqués dans la virulence : MPN372 (toxine CARDS), MPN142 (protéine de cytoadhérence) et MPN400 (protéine bloquant les IgG). Elle a ensuite été utilisée pour en cibler deux puis trois en une seule étape.Une fois le clonage et l’ingénierie du génome bactérien réalisés dans la levure, il est nécessaire de pouvoir transférer le chromosome modifié dans une cellule receveuse, afin de produire une cellule mutante. Ce processus nommé transplantation de génome n’éta |
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Néanmoins, la manipulation génétique de ce mycoplasme est difficile, en raison du nombre restreint d'outils disponibles.Une approche récemment développée propose de contourner ces limitations en utilisant la levure Saccharomyces cerevisiae comme plateforme d’ingénierie du génome de M. pneumoniae. L’étape préliminaire à cette approche consiste à cloner le génome bactérien dans la levure. Pour ce faire, une cassette « éléments levure » est insérée dans le génome de M. pneumoniae, pour permettre son maintien comme chromosome artificiel. Les travaux menés au cours de cette thèse ont permis d’insérer cette cassette par le biais d’un transposon, et de cloner ce génome marqué dans la levure. La stabilité du génome cloné a ensuite été étudiée, mettant en évidence que le chromosome bactérien est maintenu durant une dizaine de passages. Nous avons ensuite développé une nouvelle stratégie d’insertion des « éléments levure » en utilisant le système CRISPR/Cas9 pour cloner et éditer simultanément un génome de mycoplasme chez la levure : le CReasPy-Cloning. Cette méthode a été utilisée pour supprimer trois loci différents contenant des gènes impliqués dans la virulence : MPN372 (toxine CARDS), MPN142 (protéine de cytoadhérence) et MPN400 (protéine bloquant les IgG). Elle a ensuite été utilisée pour en cibler deux puis trois en une seule étape.Une fois le clonage et l’ingénierie du génome bactérien réalisés dans la levure, il est nécessaire de pouvoir transférer le chromosome modifié dans une cellule receveuse, afin de produire une cellule mutante. Ce processus nommé transplantation de génome n’étant pas décrit pour M. pneumoniae, une part importante de cette thèse a été dédiée au développement de cet outil. Nous avons utilisé la transformation de plasmides comme mécanisme modèle pour étudier le processus d’entrée de l’ADN dans M. pneumoniae et tester l’utilisation du polyéthylène glycol, le réactif clé de la transplantation. Bien qu’ayant réussi à mettre au point un protocole de transformation de plasmides, nous n’avons pas réussi pour l’instant à réaliser la transplantation de génomes.En parallèle, nous avons développé une stratégie alternative d’édition de génome qui ne dépend pas de la transplantation. Cette approche, nommée « Genomic Transfer - Recombinase-Mediated Cassette Exchange » (GT-RMCE), consiste à capturer dans un vecteur une section du génome bactérien édité présent dans la levure. Ce vecteur est transformé dans M. pneumoniae, et grâce au système Cre-lox la section éditée est introduite dans le génome. Ce mécanisme permet de réaliser des modifications de grande ampleur, et est actuellement utilisé pour introduire chez M. pneumoniae les délétions ΔMPN372, ΔMPN400 et ΔMPN372-ΔMPN400 produites par CReasPy-cloning. Nous avons également utilisé le GT-RMCE pour générer une souche de M. pneumoniae portant deux copies de l’opéron ribosomal S10.Au final, les outils d’ingénierie du génome de M. pneumoniae développés au cours de cette thèse permettent de réaliser un pas significatif vers la construction de nouveaux châssis bactériens.
A goal of synthetic biology is to create and produce “custom” organisms, for therapeutic and industrial applications. One of the contemplated approaches to achieve this goal is based on synthesis techniques and transplantation of whole genomes, in order to create mutant organisms.The aim of this thesis is to develop synthetic biology tools that will enable the construction of a minimal and non-pathogenic cell based on Mycoplasma pneumoniae. This bacterium is one of the smallest living organisms, with a size smaller than one micron and a genome of 816 kbp. This mycoplasma is one of the most studied, with a large set of genetic and multi- “omics” data available. These characteristics make this naturally “almost minimal” cell an ideal starting point for the construction of a bacterial chassis. Nevertheless, the genetic manipulation of this mycoplasma is difficult, due to the limited number of available tools.A recently developed approach offers the possibility to circumvent these limitations by using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a genome engineering platform for M. pneumoniae. The preliminary step to this strategy is to clone the bacterial genome in yeast. To do so, a "yeast elements" cassette is inserted into the genome of M. pneumoniae, to allow its maintenance as an artificial chromosome. The work carried out during this thesis allowed us to insert this cassette through a transposon, and to clone this marked genome in yeast. Then, the stability of the cloned genome was studied, demonstrating that the bacterial chromosome is maintained during ten passages. We then developed a new strategy for the insertion of the "yeast elements", using the CRISPR/Cas9 system to simultaneously clone and edit a mycoplasma genome in yeast: the CReasPy-Cloning. This method was used to remove three different loci containing genes involved in virulence: MPN372 (CARDS toxin), MPN142 (cytoadherence protein) and MPN400 (IgG blocking protein). This method was also used to target two and then three different loci in one step.Once in-yeast cloning and bacterial genome engineering is achieved, it is necessary to transfer the modified chromosome into a recipient cell, to produce a mutant organism. This process, called genome transplantation, is not described for M. pneumoniae, so a significant part of this thesis was dedicated to the development of this tool. We used plasmid transformation as a model mechanism to study the process of DNA entry into M. pneumoniae and to test the use of polyethylene glycol, the key reagent for transplantation. Although we succeeded in developing a plasmid transformation protocol, we have not yet been able to perform genome transplantation.Concurrently, we have developed an alternative strategy for genome editing that does not depend on transplantation. This approach, named "Genomic Transfer - Recombinase-Mediated Cassette Exchange" (GT-RMCE), is used to capture in a vector a section of the edited bacterial genome borne by the yeast. This vector is then transformed into M. pneumoniae, and through to the Cre-lox system the edited section is introduced into the genome. This mechanism allows to carry out large-scale modifications, and is currently used to introduce into M. pneumoniae the ΔMPN372, ΔMPN400 and ΔMPN372-ΔMPN400 deletions produced by CReasPy-cloning. We also used the GT-RMCE to generate a strain of M. pneumoniae carrying two copies of the S10 ribosomal operon.Overall, the M. pneumoniae genome engineering tools developed during this thesis constitute a significant step towards the construction of new bacterial chassis.</description><language>fre</language><subject>Bacterial chassis ; Biologie de synthèse ; Châssis bactérien ; CRISPR-Cas9 ; Genomic engineering ; Ingénierie de génomes ; Mycoplasma pneumoniae ; Synthetic biology</subject><creationdate>2019</creationdate><oa>free_for_read</oa><woscitedreferencessubscribed>false</woscitedreferencessubscribed></display><links><openurl>$$Topenurl_article</openurl><openurlfulltext>$$Topenurlfull_article</openurlfulltext><thumbnail>$$Tsyndetics_thumb_exl</thumbnail><link.rule.ids>230,311,780,885,26981</link.rule.ids><linktorsrc>$$Uhttps://www.theses.fr/2019BORD0132/document$$EView_record_in_ABES$$FView_record_in_$$GABES$$Hfree_for_read</linktorsrc></links><search><creatorcontrib>Ruiz, Estelle</creatorcontrib><title>Construction d’un châssis bactérien viable, minimal et non pathogène grâce aux outils de biologie de synthèse</title><description>Un des objectifs de la biologie de synthèse est de concevoir et produire des organismes « à façon », pour des applications thérapeutiques et industrielles. Une des voies envisagées pour atteindre cet objectif repose sur des techniques de synthèse et de transplantation de génomes entiers, afin de créer des organismes mutants.Le but de cette thèse est de développer des outils de biologie de synthèse qui permettront de construire une cellule minimale et non pathogène, à partir de Mycoplasma pneumoniae. Cette bactérie est l'un des plus petits organismes vivants, avec une taille inférieure au micron et un génome de 816 kpb. Ce mycoplasme est l’un des plus étudiés, avec une collection de données génétiques et multi-« omiques » disponibles. Ces caractéristiques font de cette cellule naturellement « quasi minimale » un point de départ idéal pour la construction d’un châssis bactérien. Néanmoins, la manipulation génétique de ce mycoplasme est difficile, en raison du nombre restreint d'outils disponibles.Une approche récemment développée propose de contourner ces limitations en utilisant la levure Saccharomyces cerevisiae comme plateforme d’ingénierie du génome de M. pneumoniae. L’étape préliminaire à cette approche consiste à cloner le génome bactérien dans la levure. Pour ce faire, une cassette « éléments levure » est insérée dans le génome de M. pneumoniae, pour permettre son maintien comme chromosome artificiel. Les travaux menés au cours de cette thèse ont permis d’insérer cette cassette par le biais d’un transposon, et de cloner ce génome marqué dans la levure. La stabilité du génome cloné a ensuite été étudiée, mettant en évidence que le chromosome bactérien est maintenu durant une dizaine de passages. Nous avons ensuite développé une nouvelle stratégie d’insertion des « éléments levure » en utilisant le système CRISPR/Cas9 pour cloner et éditer simultanément un génome de mycoplasme chez la levure : le CReasPy-Cloning. Cette méthode a été utilisée pour supprimer trois loci différents contenant des gènes impliqués dans la virulence : MPN372 (toxine CARDS), MPN142 (protéine de cytoadhérence) et MPN400 (protéine bloquant les IgG). Elle a ensuite été utilisée pour en cibler deux puis trois en une seule étape.Une fois le clonage et l’ingénierie du génome bactérien réalisés dans la levure, il est nécessaire de pouvoir transférer le chromosome modifié dans une cellule receveuse, afin de produire une cellule mutante. Ce processus nommé transplantation de génome n’étant pas décrit pour M. pneumoniae, une part importante de cette thèse a été dédiée au développement de cet outil. Nous avons utilisé la transformation de plasmides comme mécanisme modèle pour étudier le processus d’entrée de l’ADN dans M. pneumoniae et tester l’utilisation du polyéthylène glycol, le réactif clé de la transplantation. Bien qu’ayant réussi à mettre au point un protocole de transformation de plasmides, nous n’avons pas réussi pour l’instant à réaliser la transplantation de génomes.En parallèle, nous avons développé une stratégie alternative d’édition de génome qui ne dépend pas de la transplantation. Cette approche, nommée « Genomic Transfer - Recombinase-Mediated Cassette Exchange » (GT-RMCE), consiste à capturer dans un vecteur une section du génome bactérien édité présent dans la levure. Ce vecteur est transformé dans M. pneumoniae, et grâce au système Cre-lox la section éditée est introduite dans le génome. Ce mécanisme permet de réaliser des modifications de grande ampleur, et est actuellement utilisé pour introduire chez M. pneumoniae les délétions ΔMPN372, ΔMPN400 et ΔMPN372-ΔMPN400 produites par CReasPy-cloning. Nous avons également utilisé le GT-RMCE pour générer une souche de M. pneumoniae portant deux copies de l’opéron ribosomal S10.Au final, les outils d’ingénierie du génome de M. pneumoniae développés au cours de cette thèse permettent de réaliser un pas significatif vers la construction de nouveaux châssis bactériens.
A goal of synthetic biology is to create and produce “custom” organisms, for therapeutic and industrial applications. One of the contemplated approaches to achieve this goal is based on synthesis techniques and transplantation of whole genomes, in order to create mutant organisms.The aim of this thesis is to develop synthetic biology tools that will enable the construction of a minimal and non-pathogenic cell based on Mycoplasma pneumoniae. This bacterium is one of the smallest living organisms, with a size smaller than one micron and a genome of 816 kbp. This mycoplasma is one of the most studied, with a large set of genetic and multi- “omics” data available. These characteristics make this naturally “almost minimal” cell an ideal starting point for the construction of a bacterial chassis. Nevertheless, the genetic manipulation of this mycoplasma is difficult, due to the limited number of available tools.A recently developed approach offers the possibility to circumvent these limitations by using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a genome engineering platform for M. pneumoniae. The preliminary step to this strategy is to clone the bacterial genome in yeast. To do so, a "yeast elements" cassette is inserted into the genome of M. pneumoniae, to allow its maintenance as an artificial chromosome. The work carried out during this thesis allowed us to insert this cassette through a transposon, and to clone this marked genome in yeast. Then, the stability of the cloned genome was studied, demonstrating that the bacterial chromosome is maintained during ten passages. We then developed a new strategy for the insertion of the "yeast elements", using the CRISPR/Cas9 system to simultaneously clone and edit a mycoplasma genome in yeast: the CReasPy-Cloning. This method was used to remove three different loci containing genes involved in virulence: MPN372 (CARDS toxin), MPN142 (cytoadherence protein) and MPN400 (IgG blocking protein). This method was also used to target two and then three different loci in one step.Once in-yeast cloning and bacterial genome engineering is achieved, it is necessary to transfer the modified chromosome into a recipient cell, to produce a mutant organism. This process, called genome transplantation, is not described for M. pneumoniae, so a significant part of this thesis was dedicated to the development of this tool. We used plasmid transformation as a model mechanism to study the process of DNA entry into M. pneumoniae and to test the use of polyethylene glycol, the key reagent for transplantation. Although we succeeded in developing a plasmid transformation protocol, we have not yet been able to perform genome transplantation.Concurrently, we have developed an alternative strategy for genome editing that does not depend on transplantation. This approach, named "Genomic Transfer - Recombinase-Mediated Cassette Exchange" (GT-RMCE), is used to capture in a vector a section of the edited bacterial genome borne by the yeast. This vector is then transformed into M. pneumoniae, and through to the Cre-lox system the edited section is introduced into the genome. This mechanism allows to carry out large-scale modifications, and is currently used to introduce into M. pneumoniae the ΔMPN372, ΔMPN400 and ΔMPN372-ΔMPN400 deletions produced by CReasPy-cloning. We also used the GT-RMCE to generate a strain of M. pneumoniae carrying two copies of the S10 ribosomal operon.Overall, the M. pneumoniae genome engineering tools developed during this thesis constitute a significant step towards the construction of new bacterial chassis.</description><subject>Bacterial chassis</subject><subject>Biologie de synthèse</subject><subject>Châssis bactérien</subject><subject>CRISPR-Cas9</subject><subject>Genomic engineering</subject><subject>Ingénierie de génomes</subject><subject>Mycoplasma pneumoniae</subject><subject>Synthetic biology</subject><fulltext>true</fulltext><rsrctype>dissertation</rsrctype><creationdate>2019</creationdate><recordtype>dissertation</recordtype><sourceid>RS3</sourceid><recordid>eNotjDtOxDAUANNQoIUz8A5AJMdOYruE8JVWWgltj17s58RS1kGxg6DjGrRbLefITTgJi6CaaWZOs9SMIaZpNsmPAez3x-ccwPTLPkYfoUWTlq_JU4BXj-1Al7Dzwe9wAEoQjsULpn7slkMg6KZlbwhwfoNxTn6IYAlaPw5j5-nX43tI_XKIdJadOBwinf9zlW3vbrfNQ77e3D82V-scFeN5LTmitjXTyhnJuVaVEMq4WjPGbeFKrJiThasK6bhELipEblVZakVGWiFW2cXfFluKz6mneARnhb7ePN2wQnDxA2azVB8</recordid><startdate>20190916</startdate><enddate>20190916</enddate><creator>Ruiz, Estelle</creator><scope>AOWWY</scope><scope>RS3</scope><scope>~IT</scope></search><sort><creationdate>20190916</creationdate><title>Construction d’un châssis bactérien viable, minimal et non pathogène grâce aux outils de biologie de synthèse</title><author>Ruiz, Estelle</author></sort><facets><frbrtype>5</frbrtype><frbrgroupid>cdi_FETCH-LOGICAL-a802-672aa9d6098fc722985338cf69002d1f4a50f71f517f27a235aa2d84498ec7d33</frbrgroupid><rsrctype>dissertations</rsrctype><prefilter>dissertations</prefilter><language>fre</language><creationdate>2019</creationdate><topic>Bacterial chassis</topic><topic>Biologie de synthèse</topic><topic>Châssis bactérien</topic><topic>CRISPR-Cas9</topic><topic>Genomic engineering</topic><topic>Ingénierie de génomes</topic><topic>Mycoplasma pneumoniae</topic><topic>Synthetic biology</topic><toplevel>online_resources</toplevel><creatorcontrib>Ruiz, Estelle</creatorcontrib><collection>Theses.fr (Open Access)</collection><collection>Theses.fr</collection><collection>Thèses.fr</collection></facets><delivery><delcategory>Remote Search Resource</delcategory><fulltext>fulltext_linktorsrc</fulltext></delivery><addata><au>Ruiz, Estelle</au><format>dissertation</format><genre>dissertation</genre><ristype>THES</ristype><btitle>Construction d’un châssis bactérien viable, minimal et non pathogène grâce aux outils de biologie de synthèse</btitle><date>2019-09-16</date><risdate>2019</risdate><abstract>Un des objectifs de la biologie de synthèse est de concevoir et produire des organismes « à façon », pour des applications thérapeutiques et industrielles. Une des voies envisagées pour atteindre cet objectif repose sur des techniques de synthèse et de transplantation de génomes entiers, afin de créer des organismes mutants.Le but de cette thèse est de développer des outils de biologie de synthèse qui permettront de construire une cellule minimale et non pathogène, à partir de Mycoplasma pneumoniae. Cette bactérie est l'un des plus petits organismes vivants, avec une taille inférieure au micron et un génome de 816 kpb. Ce mycoplasme est l’un des plus étudiés, avec une collection de données génétiques et multi-« omiques » disponibles. Ces caractéristiques font de cette cellule naturellement « quasi minimale » un point de départ idéal pour la construction d’un châssis bactérien. Néanmoins, la manipulation génétique de ce mycoplasme est difficile, en raison du nombre restreint d'outils disponibles.Une approche récemment développée propose de contourner ces limitations en utilisant la levure Saccharomyces cerevisiae comme plateforme d’ingénierie du génome de M. pneumoniae. L’étape préliminaire à cette approche consiste à cloner le génome bactérien dans la levure. Pour ce faire, une cassette « éléments levure » est insérée dans le génome de M. pneumoniae, pour permettre son maintien comme chromosome artificiel. Les travaux menés au cours de cette thèse ont permis d’insérer cette cassette par le biais d’un transposon, et de cloner ce génome marqué dans la levure. La stabilité du génome cloné a ensuite été étudiée, mettant en évidence que le chromosome bactérien est maintenu durant une dizaine de passages. Nous avons ensuite développé une nouvelle stratégie d’insertion des « éléments levure » en utilisant le système CRISPR/Cas9 pour cloner et éditer simultanément un génome de mycoplasme chez la levure : le CReasPy-Cloning. Cette méthode a été utilisée pour supprimer trois loci différents contenant des gènes impliqués dans la virulence : MPN372 (toxine CARDS), MPN142 (protéine de cytoadhérence) et MPN400 (protéine bloquant les IgG). Elle a ensuite été utilisée pour en cibler deux puis trois en une seule étape.Une fois le clonage et l’ingénierie du génome bactérien réalisés dans la levure, il est nécessaire de pouvoir transférer le chromosome modifié dans une cellule receveuse, afin de produire une cellule mutante. Ce processus nommé transplantation de génome n’étant pas décrit pour M. pneumoniae, une part importante de cette thèse a été dédiée au développement de cet outil. Nous avons utilisé la transformation de plasmides comme mécanisme modèle pour étudier le processus d’entrée de l’ADN dans M. pneumoniae et tester l’utilisation du polyéthylène glycol, le réactif clé de la transplantation. Bien qu’ayant réussi à mettre au point un protocole de transformation de plasmides, nous n’avons pas réussi pour l’instant à réaliser la transplantation de génomes.En parallèle, nous avons développé une stratégie alternative d’édition de génome qui ne dépend pas de la transplantation. Cette approche, nommée « Genomic Transfer - Recombinase-Mediated Cassette Exchange » (GT-RMCE), consiste à capturer dans un vecteur une section du génome bactérien édité présent dans la levure. Ce vecteur est transformé dans M. pneumoniae, et grâce au système Cre-lox la section éditée est introduite dans le génome. Ce mécanisme permet de réaliser des modifications de grande ampleur, et est actuellement utilisé pour introduire chez M. pneumoniae les délétions ΔMPN372, ΔMPN400 et ΔMPN372-ΔMPN400 produites par CReasPy-cloning. Nous avons également utilisé le GT-RMCE pour générer une souche de M. pneumoniae portant deux copies de l’opéron ribosomal S10.Au final, les outils d’ingénierie du génome de M. pneumoniae développés au cours de cette thèse permettent de réaliser un pas significatif vers la construction de nouveaux châssis bactériens.
A goal of synthetic biology is to create and produce “custom” organisms, for therapeutic and industrial applications. One of the contemplated approaches to achieve this goal is based on synthesis techniques and transplantation of whole genomes, in order to create mutant organisms.The aim of this thesis is to develop synthetic biology tools that will enable the construction of a minimal and non-pathogenic cell based on Mycoplasma pneumoniae. This bacterium is one of the smallest living organisms, with a size smaller than one micron and a genome of 816 kbp. This mycoplasma is one of the most studied, with a large set of genetic and multi- “omics” data available. These characteristics make this naturally “almost minimal” cell an ideal starting point for the construction of a bacterial chassis. Nevertheless, the genetic manipulation of this mycoplasma is difficult, due to the limited number of available tools.A recently developed approach offers the possibility to circumvent these limitations by using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a genome engineering platform for M. pneumoniae. The preliminary step to this strategy is to clone the bacterial genome in yeast. To do so, a "yeast elements" cassette is inserted into the genome of M. pneumoniae, to allow its maintenance as an artificial chromosome. The work carried out during this thesis allowed us to insert this cassette through a transposon, and to clone this marked genome in yeast. Then, the stability of the cloned genome was studied, demonstrating that the bacterial chromosome is maintained during ten passages. We then developed a new strategy for the insertion of the "yeast elements", using the CRISPR/Cas9 system to simultaneously clone and edit a mycoplasma genome in yeast: the CReasPy-Cloning. This method was used to remove three different loci containing genes involved in virulence: MPN372 (CARDS toxin), MPN142 (cytoadherence protein) and MPN400 (IgG blocking protein). This method was also used to target two and then three different loci in one step.Once in-yeast cloning and bacterial genome engineering is achieved, it is necessary to transfer the modified chromosome into a recipient cell, to produce a mutant organism. This process, called genome transplantation, is not described for M. pneumoniae, so a significant part of this thesis was dedicated to the development of this tool. We used plasmid transformation as a model mechanism to study the process of DNA entry into M. pneumoniae and to test the use of polyethylene glycol, the key reagent for transplantation. Although we succeeded in developing a plasmid transformation protocol, we have not yet been able to perform genome transplantation.Concurrently, we have developed an alternative strategy for genome editing that does not depend on transplantation. This approach, named "Genomic Transfer - Recombinase-Mediated Cassette Exchange" (GT-RMCE), is used to capture in a vector a section of the edited bacterial genome borne by the yeast. This vector is then transformed into M. pneumoniae, and through to the Cre-lox system the edited section is introduced into the genome. This mechanism allows to carry out large-scale modifications, and is currently used to introduce into M. pneumoniae the ΔMPN372, ΔMPN400 and ΔMPN372-ΔMPN400 deletions produced by CReasPy-cloning. We also used the GT-RMCE to generate a strain of M. pneumoniae carrying two copies of the S10 ribosomal operon.Overall, the M. pneumoniae genome engineering tools developed during this thesis constitute a significant step towards the construction of new bacterial chassis.</abstract><oa>free_for_read</oa></addata></record> |
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