Untersuchung der RPRFamid-Bindungsstelle an ASIC3
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
[2021]
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1
EINLEITUNG
......................................................................................
1
1.1
ALLGEMEINES
ZU
YYACID-SENSING
ION
CHANNELS
(ASICS)
...............................
1
1.1.1
ENTDECKUNGSGESCHICHTE
UND
SUBTYPEN
VON
ASICS
............................
1
1.1.2
DIE
YYDEGENERIN
(DEG)ZEPITHELIAL
SODIUM
CHANNEL
(ENAC)
FAMILIE
2
1.1.3
GRUNDLEGENDE
MOLEKULARE
STRUKTUR
.....................................................
2
1.1.4
EXPRESSION
DER
ASICS
..........................................................................
4
1.1.5
PHYSIOLOGISCHE
UND
PATHOPHYSIOLOGISCHE
FUNKTION
...........................
4
1.2
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
GRUNDLAGEN
UND
KINETIK
DER
ASICS
........................
6
1.2.1
ALLGEMEINES
ZUR
ELEKTROPHYSIOLOGIE
UND
KINETIK
.................................
6
1.2.2
AKTIVIERUNG
VON
ASICS
DURCH
PROTONENBINDUNG
...............................
7
1.2.3
DESENSITIVIERUNG
VON
ASICS
................................................................
7
1.3
MODULATION
DER
DESENSITIVIERUNG
VON
ASIC3
.............................................
9
1.3.1
KLEINE
MODULIERENDE
MOLEKUELE
UND
DIE
YYNONPROTON
LIGAND-SENSING
DOMAIN
(NPLSD)
.................................
9
1.3.2
MODULIERENDE
NEUROPEPTIDE
...............................................................
10
2
ZIELSETZUNG
..................................................................................
11
3
MATERIAL
UND
METHODEN
..............................................................
12
3.1
MATERIAL
.........................................................................................................
12
3.1.1
STANDARD-CHEMIKALIEN
.......................................................................
12
3.1.2
STANDARD-LOESUNGEN
............................................................................
12
3.1.3
SPEZIELLE
MATERIALIEN
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
..............
13
3.1.4
SPEZIELLE
MATERIALIEN
FUER
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
VERSUCHE
..............
17
3.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.................................................................
18
3.2.1
HERSTELLUNG
VON
ASIC3-PLASMIDEN
MIT
PUNKTMUTATION
...................
18
3.2.1.1
GRUNDLAGEN
DER
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
..........................
19
3.2.1.2
GERICHTETE
MUTAGENESE
...............................................................
20
3.2.1.3
TRANSFORMATION
UND
ANZUCHT
......................................................
22
3.2.1.4
SEQUENZIERUNG
UND
LAGERUNG
....................................................
23
3.2.2
RNA-SYNTHESE
...................................................................................
23
3.2.2.1
LINEARISIERUNG
UND
ENZYMVERDAU
..............................................
23
3.2.2.2
AUFREINIGUNG
UND
SYNTHESE
DER
CRNA
.......................................24
3.2.2.3
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
DER
RNA
........................................24
3.2.2.4
LAGERUNG
UND
VERDUENNUNG
DER
CRNA
.......................................
25
3.3
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
METHODEN
...............................................................
26
3.3.1
PRAEPARATION
DER
OOZYTEN
...................................................................
26
3.3.2
INJEKTION
DER
CRNA
IN
OOZYTEN
..........................................................
26
3.3.3
INKUBATION
...........................................................................................27
3.3.4
ALLGEMEINES
ZUM
VERSUCHSAUFBAU
...................................................27
3.3.4.1
ZWEI-ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMME
.........................................
27
3.3.4.2
AUFBAU
VOM
MESSSTAND
..............................................................
28
3.3.5
MESSPROTOKOLL
FUER
DAS
SCREENING
DER
ASIC3-PUNKTMUTANTEN
........
29
3.4
ANALYSE
DER DATEN
.......................................................................................
31
3.4.1
ALLGEMEINES
ZUR
AUSWERTUNG
UND
STATISTISCHEN
ANALYSE
.................
31
3.4.2
PARAMETER
IM
ASIC3-MUTANTENSCREENING
........................................
31
3.4.2.1
PARAMETER
ZUR
ANALYSE
DER
PEAK-STROMAMPLITUDE
....................
32
3.4.2.2
PARAMETER
ZUR
ANALYSE
DER
RPRFAMID-MODULATION
IN
DER
DESENSITIVIERUNG
..........................................................................
32
4
ERGEBNISSE
...............................................................................
34
4.1
ASIC3-PUNKTMUTANTEN
AUS
ZWEI
VERSCHIEDENEN
PROTEINREGIONEN
..........
34
4.2
PUNKTMUTATIONEN
IN
DER
NPLSD
.................................................................
36
4.2.1
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DER
ASIC3-PUNKTMUTANTEN
DER
NPLSD
................................................................................................
36
4.2.2
RPRFAMID-EFFEKT
AUF
DIE
DESENSITIVIERUNG
VON
NPLSD-MUTANTEN
39
4.2.3
BEEINFLUSSUNG
DER
APPARENTEN
PROTONENAFFINITAET
DURCH
MUTATIONEN
IN
DER
NPLSD
..........................................................................................
42
4.2.4
ZUSAMMENFASSUNG:
NPLSD-MUTANTEN
VON
ASIC3
.........................
45
4.3
PUNKTMUTATIONEN
IN
DER
YYACIDIC
POCKET
.................................................
47
4.3.1
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DER
ASIC3-PUNKTMUTANTEN
DER
YYACIDIC
POCKET
...................................................................................
47
4.3.2
RPRFAMID-EFFEKT
AUF
DIE
DESENSITIVIERUNG
VON
YYACIDIC
POCKET
-MUTANTEN
...................................................................
50
4.3.3
BEEINFLUSSUNG
DER
APPARENTEN
PROTONENAFFINITAET
DURCH
MUTATION
DER
YYACIDIC
POCKET
....................................................................................
53
4.3.4
ZUSAMMENFASSUNG:
YYACIDIC
POCKET
-MUTANTEN
VON
ASIC3
..............
54
5
DISKUSSION
...................................................................................
56
5.1
DIE
NPLSD
ALS
KANDIDATENREGION
FUER
DIE
BINDUNG
VON
RPRFAMID
.......
56
5.1.1
SCREENINGERGEBNISSE
ALS
GRUNDLAGE
ZUR
IDENTIFIKATION
EINER
BINDUNGSSTELLE
....................................................................................
56
5.1.2
YYBINDING-GATING -PROBLEM
IN
DER
UNTEREN
YYPALM
-DOMAENE
..............
57
5.1.3
GRUNDLAGEN
DER
KINETIK
UND
ZUGANG
ZUR
NPLSD
...........................
59
5.1.4
INTERAKTIONSPARTNER
FUER
RPRFAMID
....................................................
60
5.1.5
NPLSD
ALS
BINDUNGSREGION
FUER
WEITERE
MODULIERENDE
LIGANDEN
...60
5.2
YYACIDIC
POCKET
UNWAHRSCHEINLICH
ALS
PEPTIDBINDUNGSSTELLE
....................
62
5.3
AUSSAGEKRAFT
UND
LIMITATION
DES
SCREENINGS
...........................................
63
5.3.1
LIMITATION
VON
PLANUNG
UND
SCREENINGPROTOKOLL
................................
63
5.3.2
LIMITATIONEN
DER
STATISTISCHEN
AUSWERTUNG
........................................
64
5.4
PHYSIOLOGISCHEN
RELEVANZ
DER
ARBEIT
UND
AUSBLICK
................................
66
6
ZUSAMMENFASSUNG
....................................................................
68
7
LITERATUR
.......................................................................................
69
8
ANHANG
........................................................................................
78
8.1
AUFLISTUNG
EIGENER
PUBLIKATIONEN
................................................................
78
8.2
DANKSAGUNG
.................................................................................................
79
8.3
ERKLAERUNG
GEMAESS
§
5
ABS.
1
ZUR
DATENAUFBEWAEHRUNG
............................
80
8.4
EIDESSTATTLICHE
ERKLAERUNG
GEMAESS
§
5
ABS.
(1)
UND
§
11
ABS.
(3)
12.
DER
PROMOTIONSORDNUNG
.....................................................................................
81
|
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