Zelluläre pharmakodynamische Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol) bei Patienten mit schwerer Osteoarthritis = Cellular pharmacodynamic effects of a standardized pine bark extract (pycnogenol) on patients with severe osteoarthritis
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Würzburg
2016
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| adam_text | ZELLULAERE PHARMAKODYNAMISCHE EFFEKTE EINES
STANDARDISIERTEN KIEFERNRINDENEXTRAKTES (PYCNOGENOL )
BEI PATIENTEN MIT SCHWERER OSTEOARTHRITIS
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG
DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
DER JULIUS-MAXIMILIANS-UMVERSITAT WURZBURG
VORGELEGT VON
STEFFEN JESSBERGER
AUS COLLENBERG
WURZBURG 2016
INHALTSVERZEICHNIS
A EINLEITUNG
.........................................
2
1 CHARAKTERISIERUNG VON OSTEOARTHRITIS UND DES STANDARDISIERTEN
KIEFERNRINDENEXTRAKTES
(PYCNOGENOL).....................................................................4
1.1 EPIDEMIOLOGIE, RISIKOFAKTOREN FUER OSTEOARTHRITIS UND PATHOGENESE DER
ERKRANKUNG..............................................................................................................4
1.2 MOEGLICHKEITEN ZUR STANDARDISIERTEN ERFASSUNG DER SYMPTOME IM
RAHMEN VON
OSTEOARTHRITIS...................................................................................
7
1.3 AKTUELLE THERAPIEOPTIONEN IM RAHMEN DER OSTEOARTHRITIS-BEHANDLUNG
.........
9
1.4 HERKUNFT, ZUSAMMENSETZUNG UND PHARMAKOKINETIK VON PYCNOGENOL
........
19
1.5 KLINISCHE EFFEKTE VON PYCNOGENOL UND VERGLEICHBARER PRODUKTE BEI
OSTEOARTHRITIS.............................................. 21
2 ZELLULAERE VORGAENGE IM KNORPELGEWEBE BEI
OSTEOARTHRITIS...................................30
2.1 KNORPELHOMOEOSTASE IM GESUNDEN KNIEGELENK UND VERAENDERUNGEN
WAEHREND
OSTEOARTHRITIS........................................................................................30
2.2 AUFBAU UND METABOLISMUS DES COLLAGEN-NETZWERKS IM GESUNDEN
KNORPELGEWEBE UND BEI
OSTEOARTHRITIS.............................................................43
2.3 AUF- UND ABBAU DER EZM MIT FOKUS AUF DEN AGGRECAN-STOFFWECHSEL
UND DESSEN BEDEUTUNG IM RAHMEN VON OSTEOARTHRITIS
.........
........................
49
2.4 DIE ROLLE VON LEPTIN IN DER KNORPELHOMOEOSTASE UND DER PATHOGENESE
VON
OSTEOARTHRITIS................................................................................................
53
3 ZIELSETZUNG DER
ARBEIT..............................................................................................
57
B ALLGEMEINER TEIL
.................................
60
1 PHARMAKODYNAMISCHE EFFEKTE EINES STANDARDISIERTEN
KIEFERNRINDENEXTRAKTES (PYCNOGENOL) BEI
OSTEOARTHRITIS....................................62
1.1 KLINISCHE STUDIE ZUR ERMITTLUNG DER WIRKUNG VON PYCNOGENOL BEI
FORTGESCHRITTENER GONARTHROSE
...........................................................................
62
1.2 AUSWIRKUNG DER EINNAHME DES STANDARDISIERTEN KIEFERNRINDENEXTRAKTES
AUF DIE SYMPTOMATIK DER GONARTHROSE
..............................................................
65
1.2.1 ERFASSUNG DER SYMPTOME IM RAHMEN DER OSTEOARTHRITIS-STUDIE 65
1.2.2 ERGEBNISSE DER WOMAC-SCORE-ERFASSUNG 65
1.2.3 DISKUSSION 69
1.3 EFFEKTE VON PYCNOGENOL AUF DIE GENEXPRESSION IM KNORPELGEWEBE
........
72
1.3.1 PRINZIP DER QUANTITATIVEN REAL-TIME POLYMERASE-KETTENREAKTION
(QPCR) UND ANALYTISCHES VORGEHEN NACH STANDARDISIERTEN
LEITLINIEN 72
1.3.2 PRIMERENTWURF UND PRIMERKONZENTRATIONSTESTS 78
1.3.3 HOUSEKEEPING-GEN-VALIDIERUNG 81
1.3.4 EFFIZIENZBESTIMMUNG 85
1.3.5 ERGEBNISSE DER QPCR-UNTERSUCHUNGEN 86
1.3.6 DISKUSSION 91
1.4 DIREKTER EINFLUSS VON PYCNOGENOL AUF DIE KONZENTRATION VON MARKERN
DER KNORPELHOMOEOSTASE IN SERUM UND SYNOVIALFLUESSIGKEIT
............................
99
1.4.1 EFFEKTE VON PYCNOGENOL NACH DREIWOECHIGER EINNAHME AUF DIE
KONZENTRATION VON DIVERSEN MARKERN DER KNORPELHOMOEOSTASE IM
SERUM 99
1.4.2 EINFLUSS DES STANDARDISIERTEN KIEFERNRINDENEXTRAKTES AUF DIE
KONZENTRATION VON MARKERN IN DER SYNOVIALFLUESSIGKEIT 102
1.4.3 DISKUSSION DER RESULTATE DER KONZENTRATIONSBESTIMMUNG IN
SERUM UND SYNOVIALFLUESSIGKEIT 109
1.5 BEOBACHTETE KORRELATIONEN
...............................................................................
119
1.5.1 KORRELATIONEN ZWISCHEN KONZENTRATIONEN VON MARKERN DER
KNORPELHOMOEOSTASE IN DIVERSEN SPEZIMEN 119
1.5.2 KORRELATIONEN ZWISCHEN MARKERKONZENTRATIONEN UND
KONZENTRATIONEN WICHTIGER INHALTSSTOFFE VON PYCNOGENOL IM
SERUM UND DEN BLUTZELLEN 121
1.5.3 KORRELATIONEN ZWISCHEN MARKERKONZENTRATIONEN UND
KONZENTRATIONEN WICHTIGER INHALTSSTOFFE VON PYCNOGENOL IN DER
SYNOVIALFLUESSIGKEIT 123
1.5.4 ZUSAMMENHAENGE ZWISCHEN DER GENEXPRESSION IM KNORPEL UND
KONZENTRATIONEN VON ABBAUMARKERN IN DER SYNOVIALFLUESSIGKEIT 125
1.5.5 DISKUSSION DER ERMITTELTEN KORRELATIONEN 127
1.6 EX-WVO-EFFEKTE VON SERUM NACH PYCNOGENOL-EINNAHME AUF HUMANE
PRIMAERE
CHONDROZYTEN.......................................................................................134
1.6.1 PRINZIP UND AUFBAU DER VERSUCHSDURCHFUEHRUNG 134
1.6.2 ERGEBNISSE 136
1.6.3 DISKUSSION DER EX-V/VO-VERSUCHE MIT SERUM 142
1.7 EX-WVO-EFFEKTE VON SYNOVIALFLUESSIGKEIT NACH EINNAHME DES
STANDARDISIERTEN KIEFERNRINDENEXTRAKTES AUF DIE IMMORTALISIERTE
CHONDROZYTENZELLLINIE T C 2 8
.............................................................................148
1.7.1 PRINZIP UND AUFBAU DES EX-WVO-VERSUCHES 148
1.7.2 EINFLUSS DER ZELLVIABILITAET AUF DIE ERGEBNISSE DER
EX-V/VO-VERSUCHE
MIT SYNOVIALFLUESSIGKEIT 149
1.7.3 ERGEBNISSE DER EX-V/VO-VERSUCHE MIT SYNOVIALFLUESSIGKEIT 151
1.7.4 DISKUSSION 154
2 SIMULIERUNG DES VERHALTENS AUSGEWAEHLTER BESTANDTEILE VON PYCNOGENOL
UND EINES METABOLITEN AN DER BLUT-HIRN-SCHRANKE MIT HILFE EINES
IN-VITRO-
MODELLS....................................................................................................................
158
2.1 EFFEKTE VON POLYPHENOLEN AUF DAS
GEHIRN......................................................158
2.2 PHYSIOLOGIE DER HUMANEN
BLUT-HIRN-SCHRANKE............................................... 163
2.3 AUSGEWAEHLTE MODELLE ZUR UNTERSUCHUNG DER BLUT-HIRN-
SCHRANKENGAENGIGKEIT VON
ARZNEISTOFFEN.........................................................166
2.4 CEND-ZN-V/YRO-MODELL FUER DIE ANALYSE DER AUFNAHME VON AUSGEWAEHLTEN
BESTANDTEILEN VON PYCNOGENOL UND DESSEN METABOLITEN IN DAS GEHIRN ..172
2.5 ERGEBNISSE DER
CEND-MODELL-VERSUCHE.........................................................
173
2.6
DISKUSSION............................................................................................................179
C EXPERIMENTELLER TEIL
.......................................................
192
1 PHARMAKODYNAMISCHE EFFEKTE EINES STANDARDISIERTEN
KIEFERNRINDENEXTRAKTES (PYCNOGENOL) BEI OSTEOARTHRITIS
..................................
194
1.1 REAGENZIEN UND
CHEMIKALIEN..........................................................................194
1.1.1 VERWENDETE REAGENZIEN UND CHEMIKALIEN IN DER ZELLKULTUR 194
1.1.2 SPEZIELLE REAGENZIEN UND CHEMIKALIEN ZUR DURCHFUEHRUNG VON
ELISAS 194
1.1.3 REAGENZIEN UND CHEMIKALIEN FUER RNA-ISOLIERUNG, CDNA-
SYNTHESE UND QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 195
1.2 GERAETE UND
MATERIALIEN......................................................................................
195
1.2.1 VERWENDETE GERAETE UND MATERIALIEN IN DER ZELLKULTUR 195
1.2.2 SPEZIELLE GERAETE UND MATERIALIEN FUER DIE DURCHFUEHRUNG VON
ELISAS 196
1.2.3 GERAETE UND MATERIALIEN FUER DIE RNA-ISOLIERUNG, CDNA-SYNTHESE
UND QPCR 197
1.3 HAEUFIG VERWENDETE
LOESUNGEN...........................................................................197
1.4
ZELLKULTURMEDIEN.................................................................................................
198
1.5 RANDOMISIERT-KONTROLLIERTE STUDIE ZUR ERMITTLUNG DER
PHARMAKODYNAMISCHEN EFFEKTE VON PYCNOGENOL BEI PATIENTEN MIT
SCHWERER
KNIE-OSTEOARTHRITIS............................................................................
199
1.6 ISOLIERUNG VON PRIMAEREN CHONDROZYTEN AUS HUMANEM
KNIEGELENKKNORPEL
.............................................................................................
201
1.7 GENEXPRESSIONSANALYSEN MITTELS QUANTITATIVER REAL-TIME PCR ZUR
ERMITTLUNG DER PYCNOGENOL-EFFEKTE AUF GENEBENE
......................................
205
1.7.1 RNA-ISOLATION UND CDNA-SYNTHESE 205
1.7.2 PRIMER-DESIGN 206
1.7.3 AUSWERTUNG VON QPCR-DATEN 207
1.7.4 PRIMER-KONZENTRATIONSTEST 209
1.7.5 HOUSEKEEPING-GENVALIDIERUNG 213
1.7.6 PROBENVERMESSUNG 213
1.8 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION AUSGEWAEHLTER MARKER DER
KNORPELHOMOEOSTASE IN SERUM, SYNOVIALFLUESSIGKEIT UND
ZELLKULTURUEBERSTAENDEN
....................................................................................
216
1.8.1 MATRIX-METALLOPROTEINASE 3 (MMP-3) 216
1.8.2 MATRIX-METALLOPROTEINASE 13 (MMP-13) 217
1.8.3 MATRIX-METALLOPROTEINASE 1 (MMP-1) 219
1.8.4 ADAMTS-5 220
1.8.5 ADAMTS-4 221
1.8.6 LEPTIN 222
1.8.7 LOESLICHES CD163 (SCD163) 223
1.6.8 SULFATIERTE GLUCOSAMINGLYKANE (SGAG) UEBER DEN
DIMETHYLMETHYLENBLAU (DMMB)-ASSAY 224
1.8.9 HUMANES C-TELOPEPTID (CTX-II) UND HELIX-PEPTID (HELIX-IL) VON
TYP-IL-COLLAGEN 226
1.9 EX-WVO-VERSUCHE MIT SERUM
...........................................................................
228
1.10 EX-WVO-VERSUCHE MIT SYNOVIALFLUESSIGKEIT
......................................................
230
1.10.1 AUFTAUEN VON IMMORTALISIERTEN ZELLEN 230
1.10.2 PASSAGIEREN VON TC28-ZELLEN 230
1.10.3EINFRIEREN VON ZELLEN DER CHONDROZYTEN-ZELLLINIE TC28 231
1.10.4VITALITAETSTEST DER ZELLLINIE TC28 MITTELS MTT-ASSAY 231
1.10.5PRINZIP DER BESTIMMUNG 232
1.11 STATISTISCHE
METHODEN......................................................................................
233
2 BESTIMMUNG DER AUFNAHME AUSGEWAEHLTER BESTANDTEILE VON PYCNOGENOL
UND EINES METABOLITEN IN DAS GEHIRN MIT HILFE EINES
CEND-ZN-WYRO-MODELLS. 234
2.1 SPEZIELLE REAGENZIEN UND
CHEMIKALIEN.........................................................234
2.2 GERAETE UND
MATERIALIEN......................................................................................234
2.3 HPLC-ANLAGE UND VERWENDETE FLIESSMITTEL
....................................................
235
2.4 VORBEREITUNG DES MURINEN CEND-/N-WFRO-MODELLS
........................................
235
2.5 VERWENDETE
LOESUNGEN......................................................................................236
2.6 DURCHFUEHRUNG DER
TRANSPORT-EXPERIMENTE......................................................237
2.7
FLUESSIG-FLUESSIG-EXTRAKTION.....................................................
238
2.8 HPLC-METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER STOFFKONZENTRATIONEN IN DEN
APIKALEN UND BASOLATERALEN KAMMERN
............................................................
239
2.8.1 VALIDIERUNG DER HPLC-METHODEN 240
2.9 STATISTISCHE METHODEN
................................................................................
256
D TABELLARISCHER ANHANG
..................................................
260
1 PHARMAKODYNAMISCHE EFFEKTE EINES STANDARDISIERTEN
KIEFERNRINDENEXTRAKTES (PYCNOGENOL) BEI
OSTEOARTHRITIS..................................262
1.1 KONZENTRATION UND REINHEIT VERWENDETER RNA-PROBEN FUER DIE CDNA-
SYNTHESE NACH ISOLIERUNG AUS
CHONDROZYTEN................................................ 262
1.2 ERGEBNISSE PRIMERKONZENTRATIONSTEST
.............................................................
263
1.2.1 CT-WERTE DES PRIMERKONZENTRATIONSTESTS FUER MMP-13 263
1.2.2 CT-WERTE DES PRIMERKONZENTRATIONSTESTS FUER LEPTIN 263
1.2.3 CT-WERTE DES PRIMERKONZENTRATIONSTESTS FUER ADAMTS-5 264
1.2.4 CT-WERTE DES PRIMERKONZENTRATIONSTESTS FUER IL-1 SS 265
1.2.5 CT-WERTE DES PRIMERKONZENTRATIONSTESTS FUER MMP-1 265
1.2.6 CT-WERTE DES PRIMERKONZENTRATIONSTESTS FUER MMP-3 266
1.2.7 CT-WERTE DES PRIMERKONZENTRATIONSTESTS FUER CATHEPSIN K 267
1.3 HOUSEKEEPING-GENVALIDIERUNG
........................................................................
268
1.4
EFFIZIENZBESTIMMUNG.........................................................................................269
1.5 GENEXPRESSIONSUNTERSUCHUNG
.........................................................................
270
1.5.2 LEPTIN 271
1.5.3 IL-1 SS 272
1.5.4 ADAMTS-5 273
1.5.5 MMP-1 274
1.5.6 MMP-3 275
1.5.7 CATHEPSIN K 276
1.6 KONZENTRATIONEN VON ENTZUENDUNGSMARKERN IM SERUM UND IN DER
SYNOVIALFLUESSIGKEIT.............................................................................................
277
1.6.1 KONZENTRATIONSENTWICKLUNGEN DIVERSER MARKER IM SERUM 277
1.6.2 KONZENTRATION VON MARKERN DER KNORPELHOMOEOSTASE IN DER
SYNOVIALFLUESSIGKEIT DER TEILNEHMER DER OSTEOARTHRITIS-STUDIE 285
1.6.3 KONZENTRATION VON ABBAUPRODUKTEN IN DER SYNOVIALFLUESSIGKEIT DER
PROBANDEN 286
1.7
EX-WVO-UNTERSUCHUNGEN..................................................................................287
1.7.1 EX-WVO-VERSUCHE MIT SERUM UND HUMANEN PRIMAEREN
CHONDROZYTEN BZW. TC28-ZELLEN 267
1.7.2 EX-WVO-VERSUCHE MIT SYNOVIALFLUESSIGKEIT UND TC28-ZELLEN 295
2 ERGEBNISSE DER TRANSPORTVERSUCHE MIT DEM CEND-ZN-WF/O-MODELL
...............
297
2.1 METABOLIT
M1.......................................................................................................297
2.1.1 ERGEBNISSE DER VERSUCHE UEBER 10 MIN 297
2.1.2 ERGEBNISSE DER VERSUCHE UEBER 30 MIN 297
2.1.3 ERGEBNISSE DER VERSUCHE UEBER 60 MIN 298
2.2 ERGEBNISSE FUER (+)-CATECHIN NACH 30 MIN
......................................................
298
2.3 ERGEBNISSE FUER PROTOCATECHUSAEURE
.................................................................
298
2.3.1 ERGEBNISSE DER VERSUCHE UEBER 30 MIN 298
2.3.2 ERGEBNISSE DER VERSUCHE UEBER 60 MIN 299
E ZUSAMMENFASSUNG................ 302
F
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS................................................310
G
LITERATURVERZEICHNIS......................................................316
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