Die Rolle von Kollagen IX in der Zell-Matrix-Interaktion von Knorpelzellen
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Veröffentlicht: |
2014
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INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
IV
T ABELLEN VERZEICHNIS
V
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
VI
KAPITEL
1
EINLEITUNG
1
1.1 KNORPELGEWEBE 1
1.1.1 AUFBAU: DAS CHONDRON ALS FUNKTIONELLE EINHEIT DES KNORPELGEWEBES 1
1.1.2 DER HYALINE KNORPEL 3
1.2 DIE WACHSTUMSFUGE 4
1.2.1 DIE ENTSTEHUNG DER EPIPHYSENFUGE - EIN TEMPORAERES RELIKT
CHONDRALER
OSSIFIKATION 4
1.2.2 CHONDROZYTENDIFFERENZIERUNG IN DER WACHSTUMSFUGE 7
1.2.2.1 RUHEZONE - ZONA RESERVATA 9
1.2.2.2 PROLIFERATIONSZONE - ZONAPROLIFERATIVA 9
1.2.2.3 HYPERTROPHE ZONE - ZONA HYPERTROPHICA 10
1.2.2.4 EROEFFNUNGS- (ZONA RESORBENS) UND VERKNOECHERUNGSZONE {ZONA
OSSIFICATIONIS) 10
1.3 DIE EXTRAZELLULAERE MATRIX (ECM) DES HYALINEN KNORPELS 11
1.3.1 DIE PROTEINFAMILIE DER KOLLAGENE 12
1.3.1.1 DIE KOLLAGENE II UND XI ALS VERTRETER DER FIBRILLAEREN KOLLAGENE
14
1.3.1.2 KOLLAGEN IX ALS VERTRETER DER FACIT-KOLLAGENE 17
1.4 ZELL-MATRIX-ADHAESION 20
1.4.1 INTEGRINE 20
1.4.1.1 FOKALE ADHAESIONEN 24
1.4.1.2 DIE KOLLAGEN-BINDENDEN INTEGRINE AISSI, A
2
SSI, A
:0
SSI UND ANSSI 25
1.4.2 DISCOIDIN DOMAENE-REZEPTOREN 27
1.5 EMBRYONALES HUEHNERSTERNUM 29
1.6 ZIEL DER ARBEIT 30
KAPITEL 2
MATERIAL UND METHODEN
33
2.1 MATERIAL 33
2.1.1 V ERBRAUCHSMATERIALIEN 33
2.1.2 REAGENZIEN 34
2.1.3 GERAETE 35
2.1.4 PUFFER UND LOESUNGEN 36
2.1.5 ENZYME 36
2.1.6 ZELLEN 37
2.2 METHODEN 38
2.2.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 38
2.2.1.1 PRAEPARATION VON STERNA AUS HUEHNEREMBRYONEN 38
2.2.1.2 ISOLIERUNG VON CHONDROZYTEN AUS HUEHNERSTERNA 38
2.2.1.3 ZELLZAHLBESTIMMUNG 39
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2.2.1.4 KULTIVIERUNG PRIMAERER CHONDROZYTEN IN AGAROSE 40
2.2.1.4.1 VORBEREITUNG DER BESCHICHTETEN SCHALEN 40
2.2.1.4.2 HERSTELLUNG DER AGAROSE-SUSPENSIONSKULTUR 40
2.2.1.4.3 KULTIVIERUNG DER ZELLEN 40
2.2.1.4.4 AUFBEWAHRUNG DER KULTUREN BIS ZUR KOLLAGENISOLATION 41
2.2.1.5 ADHAESIONSASSQY 42
2.2.1.5.1 BESCHICHTUNG VON 96-WE//-ZELLKULTURPLATTEN MIT PROTEINEN DER
ECM 42
2.2.1.5.2 IN VITRO FIBRILLOGENESE 43
2.2.1.5.3 WASCHEN UND BLOCKIEREN 43
2.2.1.5.4 ZELLAUSSAAT UND -ADHAESION 44
2.2.1.5.5 AUSWERTUNG 44
2.2.1.6 KOLORIMETRISCHE MESSUNG DER ZELLDICHTE ANHAND VON
KRISTALLVIOLETT 45
2.2.1.7 ZELLZAEHLUNG 46
2.2.2 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 48
2.2.2.1 ETHANOLFALLUNG VON PROTEINEN 48
2.2.2.2 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE SDS-PAGE 48
2.2.2.3 SDS-GELELEKTROPHORESE 49
2.2.2.4 COOMASSIE-FAERBUNG VON SDS-GELEN 51
2.2.2.5 ISOLIERUNG TERNAERER KOLLAGENE AUS
AGAROSE-CHONDROZYTEN-SUSPENSIONSKULTUREN 52
2.2.2.6 AUFREINIGUNG TERNAERER KOLLAGENE 53
2.2.2.7 DIALYSIEREN VON KOLLAGENEN 56
2.2.3 MIKROSKOPISCHE METHODEN 57
2.2.3.1 PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE 57
2.2.3.2 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE 57
2.2.4 GRAFIKPROGRAMME UND STATISTISCHE AUSWERTUNG 58
KAPITEL 3
ERGEBNISSE
59
3.1 KONZEPT ZUR ENTWICKLUNG DES ADHAESIONSASSAYS 60
3.2 DIE AUSWAHL EINER GEEIGNETEN MIKROTITERPLATTE: NUNC CELLSTAR,
SENSOPLATE*
UND NUNC MAXISORP IM TEST 61
3.2.1 NUNC CELLSTARFLAT-BOTTOM 96 WELLPLATE 61
3.2.2 SENSOPLATE* 96 WELLGLASS-BOTTOM PLATE 62
3.2.3 NUNC MAXISORP FLAT-BOTTOM 96 WELL PLATE 62
3.3 DIE KONTROLLE DER KOLLAGENBESCHICHTUNG 63
3.4 DIE QUANTITATIVE ERFASSUNG ADHAERENTER KNORPELZELLEN: ZELLZAEHLUNG VS.
KRISTALLVIOLETT-FAERBUNG 69
3.4.1 DIE METHODE DER ZELLZAEHLUNG IST VERLAESSLICH REPRODUZIERBAR 70
3.4.2 DIE COLORIMETRISCHE MESSUNG DER ZELLDICHTE MIT KRISTALLVIOLETT 79
3.5 GESAMTUEBERBLICK UEBER DIE VERSUCHSERGEBNISSE DER VERSCHIEDENEN
PLATTENSYSTEME 84
3.6 DER UNMITTELBARE EINFLUSS VON KOLLAGEN IX AUF DIE ZELLADHAESION
ERWEIST SICH
ALS NICHT STATISTISCH SIGNIFIKANT 85
3.6.1 UNTER EINSATZ VON STORAGE PUFFER 85
3.6.2 UNTER EINSATZ VON HEPES PUFFER 90
KAPITEL 4
DISKUSSION
98
4.1 DIE ENTWICKLUNG DES TESTSYSTEMS MIT INTERPRETATION DER GEWONNENEN
RESULTATE 98
INHALTSVERZEICHNIS III
4.2 DER EINFLUSS VON KOLLAGEN IX AUF DIE ZELLADHAESION- CHONDROZYTEN UND
IHRE
REZEPTOREN 99
4.3 DIE KOLLAGEN
X-KNOCKOUTM2U1S
WEIST EINE VERAENDERTE KOMPOSITION DER ECM
AUF - INWIEWEIT NEHMEN KOLLAGEN IX-INTERAKTOME EINFLUSS AUF DIE
ZELLADHAESION?
104
4.4 BEVORZUGEN CHONDROZYTEN MONOMERE GEGENUEBER FIBRILLEN FUER IHRE
ADHAESION?.... 111
4.5 AUSBLICK 114
ZUSAMMENFASSUNG 115
LITERATURVERZEICHNIS 117
DANKSAGUNG 127
LEBENSLAUF 128
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