Frühdiagnostik von Darmkrebs
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
DANKSAGUNG II
INHALTSVERZEICHNIS III
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII
TABELLENVERZEICHNIS IX
ZUSAMMENFASSUNG X
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS XI
1 EINLEITUNG 1
1.1 DANNKREBS 1
1.2 DARMKREBSENTSTEHUNG 2
1.2.1 ADENOM-KARZINOM-SEQUENZ 2
1.2.2 DER SERRATIERTE SIGNALWEG 4
1.3 MOLEKULARE SIGNALWEGE DERTUMORENSTEHUNG 4
1.3.1 DER MAPK-SIGNALWEG 4
1.3.2 DER WNT-SIGNALWEG 5
1.4 DARMKREBSVORSORGE 5
1.4.1 KLASSISCHE DARMKREBS-VORSORGE 5
1.4.2 BIOMARKER IN DER DARMKREBSDIAGNOSTIK 5
1.4.2.1 PROTEINMARKER 6
1.4.2.2 RNA-MARKER 6
1.4.2.3 GENOMISCHE MARKER 6
1.5 METHODISCHE GRUNDLAGEN 7
1.5.1 DNA-ISOLIERUNG AUS STUHLPROBEN 7
1.5.2 ANREICHERUNG EINER BEKANNTEN MUTATION IN EINEM CLBERSCHUSS AN
WILDTYP-DNA..
8
1.5.3 DETEKTION VON BEKANNTEN MUTATIONEN 10
1.5.3.1 MUTATIONSDETEKTION UEBER ALLELSPEZIFISCHE HYBRIDISIERUNGSSONDEN
IM
CHIPFORMAT 10
1.5.3.2 MUTATIONSDETEKTION UEBER FLUORESZENZMARKIERTE SONDEN IM REAL-TIME
ANSATZ 10
1.5.3.3 WEITERE METHODEN 11
1.5.4 NACHWEIS UNBEKANNTER MUTATIONEN IN BIOPSIEPROBEN 12
1 S6 RAHMENPROJEKT 12
1.7 WAHL DES MARKERPANELS 14
1.8 ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 15
2 MATERIAL UND METHODEN 17
III
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IMAGE 2
2.1 HERSTELLUNG DER PLASMIDMODELLE
2.1.1 PRIMER
2.1.2 DIREKTE AMPLIFIKATION
2.1.3 MUTAGENESE-PCR
2.1.4 GELELEKTROPHORESE
2.1.5 GELEXTRAKTION VON PCR-PRODUKTEN UND PLASMIDEN
2.1.6 VEKTORKLONIERUNG
2.1.7 KLONCHECK-PCR
2.1.8 PLASMIDPREPARATION
2.1.9 SEQUENZIERUNG
2.1.10 LINEARISIERUNG DER VEKTOREN
2.1.11 DNA QUANTIFIZIERUNG
2.1.11.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA MIT PICOGREEN..
2.1.11.2 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION
2.1.12 HERSTELLUNG DER VERDUENNUNGSREIHEN UND MISCHUNGEN
2.2 BESTIMMUNG VON KOPIENZAHLEN UEBER EINE REAL-TIME PCR
2.3 PCR-ANSATZ MIT SYBR GREEN UND LNA-BLOCKER
2.4 SCHMELZKURVENANALYSE UND LNA-ASSAYS
2.5 ANREICHERUNG VON DELETIONEN UND INSERTIONEN UEBER EINE
MUTATIONSSPEZIFISCHE PCR
2.5.1 MUTATIONSSPEZIFISCHE PCR APC CD1297DEL GAAGCAG
2.5.2 MUTATIONSSPEZIFISCHE PCR APC 1465 DELETION A G
2.6 BESTIMMUNG DER WIEDERFINDUNGSRATE VON MUTATIONEN
2.7 KLINISCHE PROBEN
2.7.1 STUHLEXTRAKTIONSPROTOKOLL
2.7.1.1 PROTOKOLL OPTIMIERUNGSVERSUCHE
2.7.1.2 FINALES PROTOKOLL
2.7.2 PUFFER STUHLEXTRAKTION
2.8 BIOCHIP
2.8.1 CHIP FRIZ BIOCHEM
2.8.2 ARRAYTUBE
2.8.2.1 PROZESSIERUNG DER CHIPS
2.8.2.2 PUFFER CHIPANALYSE
2.8.2.3 SONDENAUSWAHL
2.8.2.4 HERSTELLUNG DER BIOTINYLIERTEN AMPLIFIKATE
2.9 BIOPSIE-SCREENING
2.10 MUTATIONSANALYSE DER MCR-REGION DES APC-GENS
IV
IMAGE 3
3 ERGEBNISSE 39
3.1 ERSTER TEIL: METHODENVALIDIERUNG 40
3.1.1 HERSTELLUNG DER VEKTORSYSTEME 40
3.1.2 LNA-BLOCKER PCR ZUR ANREICHERUNG EINER PUNKTMUTATION IN EINEM
UEBERSCHUSS
VON WILDTYP-DNA 41
3.1.2.1 OPTIMIERUNG DER PARAMETER DER LNA-BLOCKER PCR 42
3.1.2.2 BESTIMMUNG DES DETEKTIONSLIMITS DER MUTATION BRAF CD599 GTG GAG
UEBER EINE LNA-PCR MIT HYBRIDISIERUNGSSONDEN 4 3
3.1.2.3 LNA-ASSAY MIT GENOMISCHER DNA UND STUHLPROBEN 44
3.1.2.4 LNA-ASSAY ZUR PARALLELEN DETEKTION MEHRERER MUTATIONEN 46
3.1.2.5 LNA-ASSAY ALS NACHWEIS FUER DELETIONEN UND INSERTIONEN 48
3.1.2.6 ZUSAMMENFASSUNG LNA-ASSAYS: 49
3.1.3 MUTATIONSSPEZIFISCHE PCR ZUR ANREICHERUNG VON DELETIONEN UND
INSERTIONEN.50
3.1.4 ENTWICKLUNG EINES PROTOKOLLS ZUR STUHLEXTRAKTION 51
3.1.4.1 DIFFERENTIELLE ZENTRIFUGATION 51
3.1.4.2 PROBENVOLUMEN 52
3.1.4.3 VARIATION WEITERER PARAMETER 53
3.1.4.4 EXTRAKTIONSVERGLEICH MIT DEM QIAAMP DNA STOOL MINI KIT 53
3.1.4.5 BESTIMMUNG DER KOPIENZAHL HUMANER DNA IN PROBANDENPROBEN 54
3.1.4.6 BESTIMMUNG DES DETEKTIONSLIMITS VON MUTATIONEN IN
PROBANDENPROBEN ..56
3.1.5 CHIP-BASIERTE DETEKTION VON MUTATIONEN 57
3.1.5.1 EDDA CHIP (FRIZBIOCHEM) 57
3.1.5.2 ARRAYTUBE 58
3.1.5.2.1 OPTIMIERUNG DER PARAMETER ZUR CHIPPROZESSIERUNG 58
3.1.5.2.2 EINFLUSS DES LNA-BLOCKERS AUF DIE DETEKTION 61
3.1.5.2.3 WAHL DER SONDE UND DES AMPLIFIKATS 61
3.1.5.2.4 ARRAYTUBE UEBERTRAGBARKEIT DER GEWAEHLTEN KONDITIONEN AM
BEISPIEL K RAS CD 12/13 62
3.1.5.2.5 PROOF OF CONCEPT TEST DES GESAMTSYSTEMS 63
3.2 ZWEITER TEIL: BIOPSIE-SCREENING 65
3.2.1 MUTATIONSSCREENING FUER/TPC-MCR ANHAND DER BIOPSIEN 65
3.2.2 BIOPSIE-SCREENING UEBER DIE ENTWICKELTEN LNA-ASSAYS 68
3.2.3 ZUSAMMENFASSUNG DES MUTATIONSSCREENING 70
4 DISKUSSION 72
4.1 ERSTER TEIL: METHODENVALIDIERUNG 72
4.2 ZWEITER TEIL BIOPSIE-SCREENING 82
4.3 AUSBLICK 86
V
IMAGE 4
5 LITERATURVERZEICHNIS 89
6 ANHANG 95
6.1 ERSTER TEIL: METHODENVALIDIERUNG 95
6.1.1 LNA-PCR BRAF CD599 95
6.1.2 LNA-ASSAY ANHAND VON GENOMISCHER DNA 95
6.1.3 LNA-ASSAY ALS NACHWEIS FUER APC CD1465 DELETION AG 96
6.1.4 LNA-ASSAY C77V/VS1 CODON 41 97
6.1.5 LNA-ASSAY CTNNB 1 CODON 45 98
6.1.6 MUTATIONSSPEZIFISCHE PCR FUER APC CD1297 INSERTION GAAGCAG 99
6.1.7 MUTATIONSSPEZIFISCHE PCR APC CD1465 DELETION AG 100
6.1.8 STUHLEXTRAKTION VERGLEICH QIAGEN KIT UND NEU ENTWICKELTES
PROTOKOLL 101
6.1.9 LNA-ASSAY PROBANDENSTUHLPROBEN 102
6.1.10 ARRAYTUBE GRAPHISCHE DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE 103
6.1.11 DATEN ARRAYT UBES 107
6.2 ZWEITER TEIL: MUTATIONSSCREENING FUER 4PC-MCR ANHAND DER BIOPSIEN 112
6.3 SEQUENZEN LNA-ASSAYS 127
VI
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