Molekulare Studien über zirkulierende Tumorzellen und zellfreie Nukleinsäuren in präklinischen Modellen und Patientenproben
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG III
DANKSAGUNG IV
1 EINLEITUNG 1
1.1 ALLGEMEINE EINLEITUNG 1
1.2 METASTASIERUNG 2
1.3 ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN 3
1.3.1 NACHWEISMETHODEN FUER ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN 6
1.3.1.1 ANTIKOERPERBASIERTE DETEKTIONSMETHODEN FUER CTCS 7
1.3.1.2 NACHWEISMETHODEN FUER CTCS UEBER MORPHOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN 8
1.3.1.3 PCR-BASIERTE METHODEN ZUM NACHWEIS DER CTCS 8
1.3.1.4 METHODEN ZUM NACHWEIS LEBENDER CTCS 9
1.3.1.5 ABREICHERUNG DER LEUKOZYTENPOPULATION (NEGATIVE SELEKTION) 10
1.3.2 NACHWEIS VON CTCS IM TIERMODELL 10
1.4 ZELLFREIE NUKLEINSAEUREN 12
1.4.1 ZELLFREIE, TUMORSPEZIFISCHE NUKLEINSAEUREN 14
1.4.2 ZIRKULIERENDE NUKLEINSAEUREN IM TIERMODELL 15
1.5 BRUSTKREBS 16
2 MATERIAL 18
2.1 GERAETE 18
2.2 SOFTWARE 19
2.3 SONSTIGE MATERIALIEN 19
2.4 ENZYME 20
2.5 CHEMIKALIEN UND SUBSTANZEN 20
2.6 PUFFER, MEDIEN UND ZUSAETZE 20
2.7 KIT-SYSTEME 21
2.8 ANTIKOERPER 22
2.9 ZELLLINIEN UND KULTURMEDIEN 23
OLIGONUKLEOTIDE 24
2.10 VERSUCHSTIERE UND HALTUNG 24
2.11 HUMANE PLASMAPROBEN 25
3 METHODEN 26
3.1 ZELLKULTUR 26
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 26
3.3 METHODEN ZUR IN WYRO-CHARAKTERISIERUNG DER BRUSTKREBSZELLEN 26
3.3.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 26
3.3.2 WESTERNBLOT 27
3.3.3 EXPRESSIONSANALYSE VON OBERFLAECHENPROTEINEN AM DURCHFLUSSZYTOMETER
(FACS) 27
3.3.4 EXPRESSIONSSTUDIEN VON PROTEINEN AM FLUORESZENZMIKROSKOP 28
3.4 TIERVERSUCHE 28
3.4.1 IN WVO-INJEKTIONSMODELLE 28
3.4.2 BLUTENTNAHME 29
3.4.3 BEHANDLUNGSVERSUCH 29
3.5 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS BLUT- UND PLASMAPROBEN 30
3.6 RNA-AUFREINIGUNG AUS GEWEBESTUECKEN 30
3.7 QUANTITATIVE UND QUALITATIVE BESTIMMUNGEN ISOLIERTER DNA / RNA 30
3.8 CDNA-SYNTHESE 31
3.8.1 ADNATEST 31
3.8.2 UEBRIGE PROBEN (BLUT- UND GEWEBELYSATE) 31
3.9 POLYMERASE-KETTENREAKTION ZUR BESTIMMUNG DER MARKEREXPRESSION 31
3.10 QUANTITATIVE REAL-TIME-PCR 32
3.11 BIOMARKERNACHWEISMETHODEN 33
3.11.1 NACHWEISMETHODEN VON ZIRKULIERENDEN TUMORZELLEN 33
3.11.1.1 ADNATEST 33
3.11.1.2 CELLSEARCH 34
3.11.1.3 QUALITATIVE CTC-DETEKTION OHNE ANTIKOERPERANREICHERUNG (PCR)...
35
3.11.1.3.1 NACHWEIS VON EPITHELIAL-MESENCHYMALEN VERAENDERUNGEN AUF
CTCS 35
3.11.1.4 CTC-DETEKTION UEBER DEN ZYTOSPIN 36
3.11.1.5 CTC-NACHWEIS MITTELS EPISPOT ( EPITHELIAL IMMUNOSPOT) 36
3.11.1.6 CTC-DETEKTION UEBER EINEN NANODETEKTOR (GILUPI GMBH) 37
3.11.1.7 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER CTCS UEBER DIE AMPLIFIKATION HUMANER
/4/U-SEQUENZEN (QRT-PCR) 38
3.11.2 NACHWEIS VON ZELLFREIEN NUKLEINSAEUREN 39
3.12 HISTOLOGISCHE FAERBUNG PROLIFERIERENDER ZELLEN AUF
TUMORSCHNITTPRAEPARATEN 39
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.13 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (FISH) ZUM NACHWEIS HUMANER
ZENTROMERE AUF TUMORSCHNITTPRAEPARATEN 40
4 ERGEBNISSE 41
4.1 ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN 41
4.1.1 HUMANE TUMORZELLEN LASSEN SICH MIT DEM ADNATEST IN ABHAENGIGKEIT
DER
EPCAM-EXPRESSION NACHWEISEN 41
4.1.2 MIT DER CELLSEARCH-METHODE LASSEN SICH EX VIVO 350 VON 500 ZELLEN
(70 %) WIEDERFINDEN 44
4.1.3 HUMANE TUMORZELLEN LASSEN SICH AUCH OHNE ANTIKOERPERANREICHERUNG
SENSITIV IM BLUT DER MAEUSE NACHWEISEN 45
4.1.4 DER NACHWEIS VON VITALEN TUMORZELLEN IST MIT DEM EPISPOT MOEGLICH..
46
4.1.5 DER NANODETEKTOR ZEIGT IM FLIESSSYSTEM EINE GERINGE SENSITIVITAET 47
4.1.6 DER NACHWEIS VON TUMORZELLEN UEBER DEN ZYTOSPIN WEIST EINEN HOHEN
ZELLVERLUST AUF 49
4.1.7 UEBER DIE QUANTITATIVE BESTIMMUNG HUMANER /L/U-SEQUENZEN GEHEN
TUMORZELLEN AUF EINZELZELLEBENE VERLOREN 50
4.2 NACHWEISSTUDIEN VON CTCS IN MURINEN XENOGRAFTS (IN VIVO) 52
4.2.1 CTCS LASSEN SICH UEBER EPITHELIALE MARKER IN VIVO NICHT ANREICHERN
52
4.2.2 CTCS ZEIGEN DEN VERLUST VON EPCAM, MUC-1 UND HER2 56
4.2.3 DER QUALITATIVE CTC-NACHWEIS KANN EINEN THERAPIEERFOLG NICHT
AUFZEIGEN
62
4.3 IN WVO-STUDIEN ZUM QUANTITATIVEN NACHWEIS DER CTCS 65
4.3.1 DIE QUANTITATIVE AMPLIFIKATION HUMANER ,4/U-SEQUENZEN KANN ZUM
NACHWEIS VON CTCS GENUTZT WERDEN 65
4.3.2 DER NACHWEIS VON VITALEN TUMORZELLEN KANN UNTER VERWENDUNG DES
EPISPOTS IM TIERMODELL VERFOLGT WERDEN 68
4.4 NACHWEIS VON HUMANER-DNA IN MURINEN PLASMAPROBEN (EX VIVO) 70
4.4.1 IM TIERMODELL KANN HUMANE-DNA SPEZIFISCH VOR DEM MURINEN
HINTERGRUND DETEKTIERT WERDEN 70
4.5 HUMANE TUMOR-DNA IN PLASMAPROBEN XENOTRANSPLANTIERTER MAEUSE 71
4.5.1 DIE MENGEN AN ZELLFREIEN, TUMORSPEZIFISCHEN NUKLEINSAEUREN
KORRELIERT IM
TIERMODELL MIT DER TUMORGROESSE 71
4.5.2 DER CTDNA-NACHWEIS BILDET DIE PHARMAKODYNAMIK IM THERAPIEMODELL AB
72
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.6 QUANTITATIVER NACHWEIS VON ZELLFREIER DNA IM PLASMA VON HUMANPROBEN
. 73
4.6.1 DIE KONZENTRATION AN ZELLFREIER DNA IST IN PLASMAPROBEN VON
KREBSPATIENTEN IM VERGLEICH ZU GESUNDEN INDIVIDUEN SIGNIFIKANT ERHOEHT 73
5 DISKUSSION 77
5.1 ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN 77
5.2 ZIRKULIERENDE, ZELLFREIE NUKLEINSAEUREN 84
6 ZUSAMMENFASSUNG 90
6.1 DEUTSCHE VERSION 90
6.2 ENGLISCHE VERSION 91
7 LITERATURVERZEICHNIS 92
ABKUERZUNGEN, FREMDWOERTER UND SYMBOLE 110
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