Molekulare Charakterisierung der Rolle von CTNNB1-Mutationen bei der Entstehung von stromareichen Wilms Tumoren
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2008
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung...............................................................................................................1
1.1 Nierenentwicklung..............................................................................................1
1.2 Klinik des Wilms Tumors (WT)...........................................................................3
1.2.1 Epidemiologie............................................................................................3
1.2.2 Ätiologie und Risikofaktoren......................................................................4
1.2.3 Klinische Symptomatik, Diagnosestellung und Therapie...........................4
1.2.4 Histopathologie des Wilms Tumors...........................................................6
1.2.5 Therapie und Prognose.............................................................................8
1.3 Molekulargenetische Ursachen des Wilms Tumors.........................................10
1.3.1 Das Wilms Tumor Gen WT1....................................................................12
1.3.2 Das ß-Catenin-Gen CTNNB1..................................................................15
1.3.2.1 Der kanonische Wnt/ß-Catenin-Signaltransduktionsweg 16
1.3.2.2 Der Wnt/ß-Catenin-Signalweg in der Tumorentstehung und
Nierenetwicklung 19
1.4 Ziel der Arbeit...................................................................................................21
2 Material.................................................................................................................23
2.1 Chemikalien.....................................................................................................23
2.2 Enzyme............................................................................................................23
2.2.1 Restriktionsenzyme.................................................................................23
2.2.2 Andere Enzyme.......................................................................................23
2.3 Größen- und Konzentrationsmarker.................................................................24
2.3.1 DNA-Marker............................................................................................24
2.3.2 Proteinmarker..........................................................................................24
2.4 Zelllinien...........................................................................................................24
2.5 Vektoren und Konstrukte..................................................................................25
2.6 Kulturmedien und Zellkultur-Reagenzien.........................................................25
2.6.1 Fertige Medien, Lösungen, Reagenzien und Zusätze.............................25
2.6.2 Angesetzte Medien, Lösungen, Reagenzien und Zusätze......................25
2.7 Puffer und Lösungen........................................................................................27
2.7.1 Angesetzte Puffer und Lösungen............................................................27
2.7.2 Fertige Puffer und Lösungen...................................................................29
2.8 Kits...................................................................................................................29
2.9 Oligonukleotide................................................................................................30
2.9.1 Oligonukleotide für DNA-PCR, SSCP/DHPLC und Sequenzierung........30
2.9.2 Oligonukleotide für cDNA-Synthese........................................................31
2.9.3 Oligonukleotide für RT-PCR....................................................................31
2.9.4 TaqMan Genexpression Assays-on-Demand Primer und Sonden für
Real-Time RT-PCR (Applied Biosystems)...............................................31
2.9.5 Oligonukleotide für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)....................31
2.10 Antikörper.......................................................................................................32
2.10.1 Primärantikörper....................................................................................32
2.10.2 Sekundärantikörper...............................................................................33
2.11 Verbrauchsmaterial........................................................................................33
2.12 Software.........................................................................................................33
2.13 Geräte............................................................................................................34
3 Patienten..............................................................................................................35
3.1 Patienten für die ß-Catenin-Mutationsanalyse.................................................35
3.2 Patienten für die IHC-Analyse..........................................................................39
4 Methoden..............................................................................................................40
4.1 Zellkultur..........................................................................................................42
4.1.1 Anlegen von primären Wilms Tumor-Gewebekulturen............................42
4.1.2 Kultur adhärenter Zellen..........................................................................42
4.1.3 Passagieren und Einfrieren von adhärenten Zellen.................................42
4.1.4Transfektion.............................................................................................43
4.1.4.1 Transiente Transfektion 43
4.1.5 ICG-001 -Behandlung..............................................................................44
4.1.6 Lithiumchloride- (UCI2) und Calyculin A-Behandlung von
HEK293-Zellen........................................................................................45
4.1.7 Anzüchten von adhärenten Zellen auf Objektträgern..............................45
4.2 DNA-Analysen..................................................................................................46
4.2.1 DNA-Isolierung........................................................................................46
4.2.2 DNA-Konzentrationsbestimmung............................................................48
4.2.3 Gelelektrophoresen.................................................................................48
4.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)..........................................................49
4.2.5 Nichtradioaktive SSCP............................................................................50
4.2.6 DHPLC-Analyse......................................................................................51
4.2.7 Restriktionsverdau...................................................................................53
4.2.8 Sequenzierung........................................................................................55
4.3 RNA-Analysen..................................................................................................56
4.3.1 RNA-Isolierung........................................................................................56
4.3.2 DNase-Verdau der RNA..........................................................................57
4.3.3 RNA-Konzentrationsbestimmung............................................................57
4.3.4 RNA-Qualitätsbestimmung mittels Bioanalyzer (Agilent).........................57
4.3.5 RT-PCR...................................................................................................58
4.3.5.1 Reverse Transkription 58
4.3.5.2 Semiquantitative RT-PCR 59
4.3.5.3 TaqMan Quantitative Real-Time RT-PCR 60
4.4 Microarray-Genexpressionsanalysen...............................................................61
4.5 Protein-Analysen..............................................................................................66
4.5.1 Protein-Isolierung....................................................................................66
4.5.2 Protein-Konzentrationsbestimmung nach Bradford.................................67
4.5.3 Western-Blot-(WB) Analysen...................................................................67
4.5.4 Immunohistochemie und Immunfluoreszenz...........................................70
4.5.4.1 Immunohistochemie (DAKO) 70
4.5.4.2 Immunfluoreszenz 71
4.6 Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)............................................................72
4.7 Karyotypisierung..............................................................................................74
5 Ergebnisse...........................................................................................................75
5.1 CTNNB1 -Analyse an Wilms Tumoren..............................................................75
5.1.1 CTA/A/ßy-Mutationsanalyse an DNA aus Gesamttumor..........................75
5.1.1.1 SSCP-Analyse 77
5.1.1.2 DHPLC-Analyse 78
5.1.1.3 Restriktionsverdau 80
5.1.1.4 Sequenzierung 81
5.1.1.5 Verteilung der CTNNB/-Mutationen in den histologischen
Wilms Tumor Untergruppen 84
5.1.1.6 Assoziation von CTNNB1- und WT1 -Mutationen in Wilms Tumoren 85
5.1.2 C7A/A/ß/-Mutationsanalyse an DNA aus mikrodissektierten
Tumorarealen..........................................................................................85
5.1.3 CTNNB1 -Immunohistochemie (IHC) zur Lokalisierung des Proteins
in Tumor-Paraffinschnitten......................................................................92
5.1.4 Western Blot-Analysen zur Untersuchung der CTNNB1 - und WT1 -
Expression in Wilms Tumoren.................................................................99
5.1.4.1 Optimierung der Western Blot-Analyse von Protein aus Wilms
Tumoren 99
5.1.4.2 WT1 - und CTNNB1 -Expressionsanalysen an Wilms Tumoren
mittels Western Blot 101
5.1.4.3 Nachweis des aktivierten CTNNB1 -Proteins in Wilms Tumoren 110
5.2 Etablierung von Wilms Tumor Zellkulturen.....................................................112
5.2.1 Optimierung von primären Wilms Tumor-Gewebekulturen....................112
5.2.1.1 Optimierung des Mediums für Wilms Tumorzellen mit CTNNB1-
und ivn-Mutationen an MD305-Zellen 113
5.2.1.2 Genexpressionsanalyse der MD305-Zellen in HMSC-, DMEM-
undWT-Medium 116
5.2.2 Charakterisierung der etablierten Wilms Tumor-Zellkulturen................122
5.2.2.1 RT-PCR-Analysen 123
5.2.2.2 Western Blot- Analysen 126
5.2.2.3 Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenz-Färbung 127
5.2.2.4 Genexpressionsanalysen der Wilms Tumoren in Zellkultur 129
5.2.2.5 Karyotypisierung der Tumorzellen 141
5.3 Identifizierung putativer ß-Catenin Zielgene...................................................143
5.3.1 Inhibierung von ß-Catenin in Wilms Tumorzellen durch ICG-001..........143
5.3.1.1 Etablierung der ICG-001-Behandlung von Tumorzellen 144
5.3.1.2 RT-PCR Analyse der ICG-001 -behandelten MD305-Tumorzellen 145
5.3.1.3 Expressionsanalyse der Tumorzellen vor und nach ICG-001-
Behandlung 146
5.3.1.4 Sequenzanalyse der durch ICG-001 beeinflussten ß-Catenin-
Zielgenen 152
5.3.2 Verifizierung von ß-Catenin-Zielgenen mittels ChIP..............................153
5.3.2.1 Etablierung der ChlP-Methode in Wilms Tumorzellen 155
5.3.2.2 Analyse von ß-Catenin-Zielgenen in Wilms Tumoren mittels ChIP 157
5.4 Experimente zur möglichen Regulation von ß-Catenin durch WT1................159
5.4.1 WH-Transfektion von HEK293-Zellen..................................................160
5.4.1.1 Expressionsanalyse auf RNA-Ebene durch Real-Time RT-PCR 161
5.4.1.2 Expressionsanalyse auf Protein-Ebene durch Western Blot 163
6 Diskussion.........................................................................................................165
6.1 CTNNB1-Analyse...........................................................................................165
6.1.1 CTA//Vß7-Mutationsanalyse...................................................................165
6.1.2 Mikrodissektions-Analyse......................................................................173
6.1.3 CTNNB1-Immunohistochemie (IHC).....................................................176
6.1.4 Western Blot-Analysen (WB).................................................................179
6.2 Wilms Tumor Zellkulturen..............................................................................183
6.2.1 Optimierung der Wilms Tumor-Gewebekulturen...................................183
6.2.2 Charakterisierung von Wilms Tumoren in Zellkultur..............................186
6.3 Identifizierung putativer CTNNBI-Zielgene....................................................195
6.3.1 Inhibierung der CBP-abhangigen CTNNB1/TCF-vermittelten
Transkription durch ICG-001..................................................................196
6.3.2 Verifizierung von p-Catenin-Zielgenen mittels ChIP..............................201
6.4 Regulation von (3-Catenin durch WT1............................................................202
7 Zusammenfassung............................................................................................204
8 Abstract..............................................................................................................206
9 Literaturverzeichnis...........................................................................................208
Danksagung
Erklarung
Lebenslauf
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