3ß-Hydroxysteroiddehydrogenasen aus Digitalis lanata und Erysimum crepidifolium

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Frankenstein, Jördis 1978- (VerfasserIn)
Format: Abschlussarbeit Buch
Sprache:German
Veröffentlicht: 2008
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adam_text Inhaltsverzeichnis A Einleitung 1 A 1. Die Verbreitung herzwirksamer Glykoside in der Pflanzenwelt 1 A 2. Die Gattungen Digitalis L. und Erysimum L 2 A2.1 Inhaltsstoffgruppen in Digitalis und Erysimum 3 A2.2 Herzwirksame Glykoside in Digitalis und Erysimum 3 A 2.3 Herzwirksame Glykoside in D. lanata und E. crepidifolium 6 A 2.4 Anwendung herzwirksamer Glykoside 7 A 3. Putativer Biosyntheseweg des Cardenolidgrundgerüsts in Digitalis 8 A4. Die 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (3ß-HSD) 10 A5. Problemstellung 12 B Material und Methoden 13 B 1 Allgemein 13 B1.1 Wasser 13 B 1.2 Proteinbestimmung 13 B 1.3 Entsalzen, Umpuffern und Einengen von Proteinlösungen 14 B 1.4 Dünnschichtchromatographie (DC) 14 B 1.5 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC) 15 B1.6SDS-Page 15 B 1.6.1 Gelzusammensetzung und Probenvorbereitung 16 B 1.6.2 Lösungen und Puffer 16 B 1.7 Isoelektrische Fokussierung 17 B 1.8 Silberfärbung 18 B 2 Rekombinante Form der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (pQ3ß-HSD) 19 B2.1 Expression der pQ3ß-HSD 19 B2.2 Native His-tag-Reinigung der pQ3ß-HSD 20 B 2.2.1 Proteinextraktion 20 B 2.2.2 Reinigung unter nativen Bedingungen 20 B 2.2.3 Verwendete Puffer 21 B 2.3 Standardassay der pQ3ß-HSD 21 B 2.4 Untersuchungen zur Ketosteroidisomeraseaktivität 23 B 3 Native 3ß-HSD aus Erysimum-Men 23 B 3.1 Pflanzen- und Kulturmaterial 23 B 3.2 Kulturbedingungen und Nährmedien 24 B 3.2.1 Sprosskulturen 24 Inhaltsverzeichnis . B 3.2.2 Kalluskulturen 25 B 3.2.3 Suspensionskulturen 25 B 3.2.4 Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien 25 B3.3 Herzglykosidspektrum in Erysimum crepidifolium 27 B 3.4 Enzymextraktion 27 B 3.5 Standardassay der nativen 3ß-HSD 28 B 3.6 Proteinreinigung 29 B 3.6.1 Ammoniumsulfatfällung 30 B 3.6.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6FF 30 B 3.6.3 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 31 B 3.6.4 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow... 32 B 3.6.5 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 33 B 3.6.6 Gelfiltration an Superdex 75 33 B 4 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 34 B4.1 Chemikalien 34 B 4.2 Verbrauchsmaterialien 36 B 5 Geräte und Zubehör 37 C Ergebnisse 40 C 1 Rekombinante Form der 3ß-HSD aus Digitalis lanata (pQ3ß-HSD) 40 C 1.1 Nachweis der katalytischen Aktivität 40 C 1.2Substratspezifrtät 41 C 1.2.1 Substrate für die Oxidationsreaktion 43 C 1.2.1.1 Steroide mit ß-ständiger C3-Hydroxylgruppe 43 C 1.2.1.2 Steroide mit a-ständiger C3-Hydroxylgruppe 47 C 1.2.1.3 Steroide mit ß-ständiger C17-Hydroxylgruppe 48 C 1.2.2 Substrate für die Reduktionsreaktion 49 C 1.3Cosubstratspezifität 51 C 1.4 Stabilitätstest 52 C 1.4.1 Stabilitätstest bei 4 C 52 C 1.4.2 Stabilitätstest bei -20 C und -80 C 53 C 1.5 pH-Optimum 54 C 1.5.1 pH-Optimum der Oxidationsreaktion 54 C 1.5.2 pH-Optimum der Reduktionsreaktion 55 C 1.6 Temperaturoptimum 55 Inhaltsverzeichnis C 1.6.1 Temperaturoptimum der Oxidationsreaktion 56 C 1.6.2 Temperaturoptimum der Reduktionsreaktion 56 C 1.7 Einfluss zweiwertiger Metallionen 57 C 1.8 Bestimmung des isoelektrischen Punktes 58 C 1.9 Enzymkinetik 58 C 1.9.1 Enzymkinetik ausgewählter Substrate der Oxidationsreaktion 59 C 1.9.2 Enzymkinetik ausgewählter Substrate der Reduktionsreaktion 62 C 1.9.3 Enzymkinetik der Cosubstrate 64 C 1.9.3.1 NAD als Cosubstrat 64 C 1.9.3.2 NADH als Cosubstrat 65 C 1.9.4 Enzymkinetische Daten im Überblick 66 C 1.10 Untersuchungen der pQ3ß-HSD auf Ketosteroidisomeraseaktivität....66 C 1.10.1 Aktivitätsvergleich von Suspensionskultur und pQ3ß-HSD (O. lanata) 66 C 1.10.2 KSI aus D. lanata in Abhängigkeit der Proteinkonzentration 68 C 1.10.3 Untersuchung auf KSI-Aktivität bei KSI-Bedingungen 69 C 1.10.4 Untersuchung auf KSI-Aktivität bei 3ß-HSD-Bedingungen 70 C 1.10.5 Untersuchung auf KSI-Aktivität mit verschiedenen Substraten 71 C 1.10.6 Zeitkinetik der Autoisomerisierung mit verschiedenen Cosubstraten 72 C 1.11 Kontrollexperimente mit Bakterienkultur 73 C 2 Native 3ß-HSD aus Erysimum crepidifolium (Ecre3ß-HSD) 76 C 2.1 Nachweis der katalytischen Aktivität 76 C 2.1.1 Aktivität in E. allionii 76 C 2.1.2 Aktivität in E. crepidifolium 77 C 2.2 Herzwirksame Glykoside in E. crepidifolium 78 C 2.3 Vorversuche mit E. crepidifolium - Suspensionskultur 79 C 2.3.1 Korrelation zwischen Enzymaktivität und Proteingehalt bei langer Inkubationszeit 79 C 2.3.2 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Inkubationszeit 80 C 2.3.3 Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 81 C 2.3.4 Untersuchung der Salzabhängigkeit 82 C 2.3.5 Bestimmung der Aktivität mit NaR pH 6,0 - 7,8 83 C 2.3.6 Extraktionspuffervergleich von NaPi pH 6,4 mit pH 7,8 84 Inhaltsverzeichnis C 2.3.7 Thermische Behandlung des Rohextraktes 85 C 2.3.8 Korrelation zwischen Proteingehalt und Enzymaktivität bei pH 6,4 ... 86 C 2.3.9 Ermittlung der Inkubationszeit 87 C 2.3.10 Substratspezifität bei pH 6,4 und 7,8 88 C 2.3.11 Bestimmung des pH-Optimums 90 C 2.3.12 Stabilitätstest mit verschiedenen Pufferzusätzen 91 C 2.3.12.1 Stabilität mit Pregnenolon als Substrat 92 C 2.3.12.2 Stabilität mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 93 C 2.3.13 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6FF 94 C 2.3.14 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow.. 97 C 2.3.15 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 98 C 2.3.16 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 100 C 2.4 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Suspensionskultur 102 C 2.4.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 102 C 2.4.2 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 103 C 2.4.3 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose FF 103 C 2.4.4 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 105 C 2.4.5 Gelfiltration an Superdex 75 106 C 2.4.6 SDS-Page 107 C 2.4.7 Reinigungsbilanz 108 C 2.5 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Blattmaterial 109 C 2.5.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 109 C 2.5.2 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 110 C 2.5.3 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose FF 110 C 2.5.4 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 112 C 2.5.5 Gelfiltration an Superdex 75 114 C 2.5.6 SDS-Page 115 C 2.5.7 Reinigungsbilanz 117 C 2.6 Stabilität bei -20*C 118 C 2.7 Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 118 D Diskussion 121 D 1 Rekombinante Form der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase aus D. lanata.. 121 Inhaltsverzeichnis D 1.1 Substratspezifität 121 D 1.1.1 Steroide mit ß-ständiger C3-Hydroxylgruppe 122 D 1.1.2 Steroide mit a-ständiger C3-Hydroxylgruppe 123 D 1.1.3 17ß-Oxidoreduktaseaktivität 124 D 1.1.4. Reduktionsreaktionen der pQ3ß-HSD 124 D1.2Cosubstratspezifität 127 D 1.3 Inhibierung durch zweiwertige Metallionen 128 D 1.4 pH-Optimum und isoelektrischer Punkt 128 D 1.5 Temperaturoptimum 129 D 1.6 Enzymkinetik 130 D 1.7 Untersuchungen der pQ3ß-HSD bezüglich Ketosteroidisomeraseaktivität 132 D2 Native 3ß-HSD aus Erysimum crepidifolium 138 D 2.1 Vorversuche zur Reinigung der Ecre3ß-HSD 138 D 2.1.1 Vorversuche mit Pregnenolon und 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 140 D 2.2 pH-Optimum 142 D 2.3 Stabilität 143 D 2.4 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Suspensionskultur 143 D 2.5 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus £. crepidifolium - Blattmaterial 145 D 2.6 Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 148 E Zusammenfassung 151 ESummary 152 F Literaturverzeichnis 153 G Anhang 161 G 1. Abkürzungsverzeichnis 161 G2. Abbildungsverzeichnis 162 G 3. Tabellenverzeichnis 166 G4. Publikationsliste 167 Anhang G 2. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Gemeinsame Zuckerkomponenten der herzwirksamen Glykoside aus Erysimum und Digitalis 5 Abbildung 2 Postulierter Biosyntheseweg des Cardenolidgrundgerüstes in Digitalis.» Abbildung 3 Reaktionsmechanismus der tierischen 3ß-HSD am Beispiel von Pregnenolon als Substrat 11 Abbildung 4 DC des Aktivitätstests pQ3ß-HSD mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen und Inkubationszeiten 40 Abbildung 5 Getestete Substrate der pQ3ß-HSD 42 Abbildung 6 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 43 Abbildung 7 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 44 Abbildung 8 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 21-OH-Pregnenolon als Substrat. 44 Abbildung 9 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5-Androsten-3ß-ol-17-on als Substrat 45 Abbildung 10 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Xysmalogenin als Substrat 45 Abbildung 11 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Digitoxigenin als Substrat 46 Abbildung 12 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Cholesterol als Substrat 46 Abbildung 13 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3a-ol-20-on als Substrat 47 Abbildung 14 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3a-ol-20-on als Substrat 48 Abbildung 15 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Testosteron als Substrat 48 Abbildung 16 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3,20-dion als Substrat 49 Abbildung 17 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3,20-dion als Substrat 50 Abbildung 18 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Progesteron als Substrat 50 Abbildung 19 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit4-Androsten-3,17-dion als Substrat 51 Abbildung 20 Diagramm des Stabilitätstests bei 4 C. Die spezifische Aktivität pQ3ß- HSD an verschiedenen Tagen 53 Abbildung 21 Diagramm der pH-Optimum-Bestimmung der pQ3ß-HSD für die Oxidationsreaktion 54 Abbildung 22 Diagramm der pH-Optimum-Bestimmung der pQ3ß-HSD für die Reduktionsreaktion 55 Abbildung 23 Diagramm der Bestimmung des Temperaturoptimums der Oxidationsreaktion von pQ3ß-HSD 56 Abbildung 24 Diagramm der Bestimmung des Temperaturoptimums der Reduktionsreaktion von pQ3ß-HSD 57 Abbildung 25 Diagramm des Einflusses zweiwertiger Metallionen auf die Aktivität derpQ3ß-HSD 57 Abbildung 26 lEF-Gel der pQ3ß-HSD nach Silberfärbung 58 Abbildung 27 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat und Hanes-Plot 60 Abbildung 28 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol- 20-on als Substrat und Hanes-Plot 60 162 Anhang Abbildung 29 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3ß-ol- 20-on als Substrat und Hanes-Plot 61 Abbildung 30 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Androstenolon als Substrat und Hanes-Plot 61 Abbildung 31 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Testosteron als Substrat und Hanes-Plot 62 Abbildung 32 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3,20- dion als Substrat und Hanes-Plot 63 Abbildung 33 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3,20- dion als Substrat und Hanes-Plot 63 Abbildung 34 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat und Hanes-Plot 64 Abbildung 35 Hanes-Auftragung von NAD 65 Abbildung 36 Hanes-Auftragung von NADH 65 Abbildung 37 Diagramm des Vergleiches von pQ3ß-HSD mit Rohextrakt (RE) von Digitalis lanata 67 Abbildung 38 Diagramm der Ketosteroidisomeraseaktivität und Autoisomerisierung in D. lanata bei verschiedenen Proteinkonzentrationen 69 Abbildung 39 Diagramm der Zeitkinetik mit Isoprogesteron als Substrat bei 37 C (KSI-Bedingungen) 70 Abbildung 40 Diagramm der Zeitkinetik pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat bei 50 C (3ß-HSD-Bedingungen) 70 Abbildung 41 Diagramm der Untersuchung von pQ3ß-HSD auf KSI-Aktivität mit verschiedenen Substraten 72 Abbildung 42 Diagramm der Zeitkinetik pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat und verschiedenen Cosubstraten 73 Abbildung 43 DC der Reaktion der Negativkontrolle (endogene Bakterienenzyme) mit 5ß-Pregnan-3,20-dion und 5ß-Pregnan-3a-ol-20-on als Substrate 74 Abbildung 44 Diagramm der Reaktion der Negativkontrollen (endogene Bakterienenzyme) der Substrate Isoprogesteron und Testosteron verglichen mit der Reaktion von pQ3ß-HSD 75 Abbildung 45 DC des Aktivitätstests von Eall3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat. 77 Abbildung 46 DC des Aktivitätstests von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat. 77 Abbildung 47 DC der in E. crepidifolium enthaltenen herzwirksamen Glykoside 78 Abbildung 48 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei verschiedenen Proteinkonzentrationen und Inkubation über Nacht 79 Abbildung 49 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei verschiedenen Inkubationszeiten und gleich bleibender Proteinkonzentration. .80 Abbildung 50 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei 25 - 70%iger Ammoniumsulfatfällung 81 Abbildung 51 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat zur Untersuchung der Salzabhängigkeit. 82 Abbildung 52 Bestimmung der Aktivität mit NaPi pH 6,0 - 7,8 bei 2,5 h lnkubation.83 Abbildung 53 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat im Extraktionspuffervergleich bei 2 h Inkubation 84 Abbildung 54 Thermische Behandlung des Rohextraktes von E. crepidifolium 85 Abbildung 55 Diagramm zur Bestimmung des Einflusses des Proteingehalts auf die Aktivität für Ecre3ß-HSD 86 163 Anhang Abbildung 56 Diagramm zur Ermittlung des linearen Bereiches der Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Inkubationszeit für Ecre3ß-HSD 87 Abbildung 57 DC der Reaktionen von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon und Testosteron als Substrate 88 Abbildung 58 DC der Reaktionen von Ecre3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on und 5ß-Pregnan-3,20-dion als Substrate 89 Abbildung 59 Diagramm zur Ermittlung des pH-Optimums der Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat 90 Abbildung 60 Diagramm zur Ermittlung des pH-Optimums der Ecre3ß-HSD mit 5ß- Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 91 Abbildung 61 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die Substrate Pregnenolon und 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on an Tag 0 der Stabilitätsprüfung mit verschiedenen Pufferzusätzen 92 Abbildung 62 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die Stabilitätsprüfung mit Pregnenolon als Substrat 93 Abbildung 63 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die Stabilitätsprüfung mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 93 Abbildung 64 Elutionsprofil an Phenylsepharose 6FF mit 0,8M (NH4 2SO4 95 Abbildung 65 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß- HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 95 Abbildung 66 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an Phenylsepharose 6FF mit 0.75M (NH4)2SO4 96 Abbildung 67 Diagramm der Aktivität der Ecre3ß-HSD1 vor und nach Säulenchromatographie an Phenylsepharose 6FF 96 Abbildung 68 Elutionsprofil an SP Sepharose Fast Flow mit 0,5 M NaCI 97 Abbildung 69 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß- HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 98 Abbildung 70 Elutionsprofil an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI 99 Abbildung 71 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß- HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 99 Abbildung 72 Elutionsprofil an Source 30Q mit 0,5 M NaCI 100 Abbildung 73 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß- HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 101 Abbildung 74 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung der Ecre3ß-HSD1 aus dem Proteinrohextrakt bei Reinigung 1 102 Abbildung 75 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an SP Sepharose Fast Flow mit 0,5 M NaCI bei Reinigung 1 104 Abbildung 76 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow bei Reinigung 1 104 Abbildung 77 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI bei Reinigung 1 105 Abbildung 78 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP bei Reinigung 1 106 Abbildung 79 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP bei Reinigung 1 107 Abbildung 80 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung der Ecre3ß-HSD1 aus dem Proteinrohextrakt bei Reinigung 2 109 Abbildung 81 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an SP Sepharose Fast Flow mit 0.5 M NaCI Reinigung 2 111 164 Anhang Abbildung 82 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow Reinigung 2, 111 Abbildung 83 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI Reinigung 2 112 Abbildung 84 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP Reinigung 2 113 Abbildung 85 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an Superdex 75 114 Abbildung 86 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Gelfiltration an Superdex 75 115 Abbildung 87 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP bei Reinigung 2 116 Abbildung 88 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Gelfiltration an Superdex 75. 116 Abbildung 89 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Stabilitätsprüfung bei-20 C 118 Abbildung 90 DC der Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und Isoprogesteron als Substrate 119 Abbildung 91 DC der Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 mit 5ß- Pregnan-3,20-dion und Testosteron als Substrate 120 Abbildung 92 Strukturmerkmale untersuchter Substrate 121 Abbildung 93 Zusammenspiel von 3a-HSD und 5a-Reduktase in der Ratte (nach Wiebe et al., 1994) 125 Abbildung 94 Allgemeiner Mechanismus der nicht-enzymatischen Isomerisierung nach Houck und Pollack (2003) 135 Abbildung 95 Reaktionsmechanismus der Ketosteroidisomerase nach Pollack (2004) 136 165 Anhang G 3. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Ausgewählte cardenolidführende Pflanzenfamilien und ihre Vertreter nach Hansel und Sticher (2004) 1 Tabelle 2: Inhaltsstoffgruppen der Gattungen Digitalis und Erysimum neben den Cardenoliden 3 Tabelle 3: Cardenolidgrundgerüst und die in den Gattungen Digitalis und Erysimum vorkommenden Aglyka, abgewandelt nach Luckner und Wichtl (2000) 4 Tabelle 4: Hauptcardenolide in E. crepidifolium 7 Tabelle 5: Aktivität mit verschiedenen Cosubstraten 52 Tabelle 6: Km- und VmarWerte pQ3ß-HSD 66 Tabelle 7: Bilanz der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus Suspensionskultur von E. crepidifolium 108 Tabelle 8: Bilanz der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus Blattmaterial von E. crepidifolium 117 Tabelle 9: Enzyme für die Umwandlung von 5a- und 5ß-Pregnanen in Digitalis.... 125 Tabelle 10: Temperaturoptima der Hydroxysteroid-Oxidoreduktasen aus D/g/ta/Js.130 Tabelle 11: Substrate der pQ3ß-HSD und ihre kinetischen Konstanten im Vergleich mit den von Finsterbusch et al. (1999) bestimmten Parameter 131 Tabelle 12: Vergleich der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium Suspensionskultur und Blattmaterial 146 Tabelle 13: Gegenüberstellung einiger Eigenschaften der Ecre3ß-HSD1 und Dlan3ß- HSD (Finsterbusch, 1999) 150 166
adam_txt Inhaltsverzeichnis A Einleitung 1 A 1. Die Verbreitung herzwirksamer Glykoside in der Pflanzenwelt 1 A 2. Die Gattungen Digitalis L. und Erysimum L 2 A2.1 Inhaltsstoffgruppen in Digitalis und Erysimum 3 A2.2 Herzwirksame Glykoside in Digitalis und Erysimum 3 A 2.3 Herzwirksame Glykoside in D. lanata und E. crepidifolium 6 A 2.4 Anwendung herzwirksamer Glykoside 7 A 3. Putativer Biosyntheseweg des Cardenolidgrundgerüsts in Digitalis 8 A4. Die 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (3ß-HSD) 10 A5. Problemstellung 12 B Material und Methoden 13 B 1 Allgemein 13 B1.1 Wasser 13 B 1.2 Proteinbestimmung 13 B 1.3 Entsalzen, Umpuffern und Einengen von Proteinlösungen 14 B 1.4 Dünnschichtchromatographie (DC) 14 B 1.5 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC) 15 B1.6SDS-Page 15 B 1.6.1 Gelzusammensetzung und Probenvorbereitung 16 B 1.6.2 Lösungen und Puffer 16 B 1.7 Isoelektrische Fokussierung 17 B 1.8 Silberfärbung 18 B 2 Rekombinante Form der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (pQ3ß-HSD) 19 B2.1 Expression der pQ3ß-HSD 19 B2.2 Native His-tag-Reinigung der pQ3ß-HSD 20 B 2.2.1 Proteinextraktion 20 B 2.2.2 Reinigung unter nativen Bedingungen 20 B 2.2.3 Verwendete Puffer 21 B 2.3 Standardassay der pQ3ß-HSD 21 B 2.4 Untersuchungen zur Ketosteroidisomeraseaktivität 23 B 3 Native 3ß-HSD aus Erysimum-Men 23 B 3.1 Pflanzen- und Kulturmaterial 23 B 3.2 Kulturbedingungen und Nährmedien 24 B 3.2.1 Sprosskulturen 24 Inhaltsverzeichnis . B 3.2.2 Kalluskulturen 25 B 3.2.3 Suspensionskulturen 25 B 3.2.4 Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien 25 B3.3 Herzglykosidspektrum in Erysimum crepidifolium 27 B 3.4 Enzymextraktion 27 B 3.5 Standardassay der nativen 3ß-HSD 28 B 3.6 Proteinreinigung 29 B 3.6.1 Ammoniumsulfatfällung 30 B 3.6.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6FF 30 B 3.6.3 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 31 B 3.6.4 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow. 32 B 3.6.5 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 33 B 3.6.6 Gelfiltration an Superdex 75 33 B 4 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 34 B4.1 Chemikalien 34 B 4.2 Verbrauchsmaterialien 36 B 5 Geräte und Zubehör 37 C Ergebnisse 40 C 1 Rekombinante Form der 3ß-HSD aus Digitalis lanata (pQ3ß-HSD) 40 C 1.1 Nachweis der katalytischen Aktivität 40 C 1.2Substratspezifrtät 41 C 1.2.1 Substrate für die Oxidationsreaktion 43 C 1.2.1.1 Steroide mit ß-ständiger C3-Hydroxylgruppe 43 C 1.2.1.2 Steroide mit a-ständiger C3-Hydroxylgruppe 47 C 1.2.1.3 Steroide mit ß-ständiger C17-Hydroxylgruppe 48 C 1.2.2 Substrate für die Reduktionsreaktion 49 C 1.3Cosubstratspezifität 51 C 1.4 Stabilitätstest 52 C 1.4.1 Stabilitätstest bei 4 "C 52 C 1.4.2 Stabilitätstest bei -20 'C und -80 "C 53 C 1.5 pH-Optimum 54 C 1.5.1 pH-Optimum der Oxidationsreaktion 54 C 1.5.2 pH-Optimum der Reduktionsreaktion 55 C 1.6 Temperaturoptimum 55 Inhaltsverzeichnis C 1.6.1 Temperaturoptimum der Oxidationsreaktion 56 C 1.6.2 Temperaturoptimum der Reduktionsreaktion 56 C 1.7 Einfluss zweiwertiger Metallionen 57 C 1.8 Bestimmung des isoelektrischen Punktes 58 C 1.9 Enzymkinetik 58 C 1.9.1 Enzymkinetik ausgewählter Substrate der Oxidationsreaktion 59 C 1.9.2 Enzymkinetik ausgewählter Substrate der Reduktionsreaktion 62 C 1.9.3 Enzymkinetik der Cosubstrate 64 C 1.9.3.1 NAD als Cosubstrat 64 C 1.9.3.2 NADH als Cosubstrat 65 C 1.9.4 Enzymkinetische Daten im Überblick 66 C 1.10 Untersuchungen der pQ3ß-HSD auf Ketosteroidisomeraseaktivität.66 C 1.10.1 Aktivitätsvergleich von Suspensionskultur und pQ3ß-HSD (O. lanata) 66 C 1.10.2 KSI aus D. lanata in Abhängigkeit der Proteinkonzentration 68 C 1.10.3 Untersuchung auf KSI-Aktivität bei KSI-Bedingungen 69 C 1.10.4 Untersuchung auf KSI-Aktivität bei 3ß-HSD-Bedingungen 70 C 1.10.5 Untersuchung auf KSI-Aktivität mit verschiedenen Substraten 71 C 1.10.6 Zeitkinetik der Autoisomerisierung mit verschiedenen Cosubstraten 72 C 1.11 Kontrollexperimente mit Bakterienkultur 73 C 2 Native 3ß-HSD aus Erysimum crepidifolium (Ecre3ß-HSD) 76 C 2.1 Nachweis der katalytischen Aktivität 76 C 2.1.1 Aktivität in E. allionii 76 C 2.1.2 Aktivität in E. crepidifolium 77 C 2.2 Herzwirksame Glykoside in E. crepidifolium 78 C 2.3 Vorversuche mit E. crepidifolium - Suspensionskultur 79 C 2.3.1 Korrelation zwischen Enzymaktivität und Proteingehalt bei langer Inkubationszeit 79 C 2.3.2 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Inkubationszeit 80 C 2.3.3 Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 81 C 2.3.4 Untersuchung der Salzabhängigkeit 82 C 2.3.5 Bestimmung der Aktivität mit NaR pH 6,0 - 7,8 83 C 2.3.6 Extraktionspuffervergleich von NaPi pH 6,4 mit pH 7,8 84 Inhaltsverzeichnis C 2.3.7 Thermische Behandlung des Rohextraktes 85 C 2.3.8 Korrelation zwischen Proteingehalt und Enzymaktivität bei pH 6,4 . 86 C 2.3.9 Ermittlung der Inkubationszeit 87 C 2.3.10 Substratspezifität bei pH 6,4 und 7,8 88 C 2.3.11 Bestimmung des pH-Optimums 90 C 2.3.12 Stabilitätstest mit verschiedenen Pufferzusätzen 91 C 2.3.12.1 Stabilität mit Pregnenolon als Substrat 92 C 2.3.12.2 Stabilität mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 93 C 2.3.13 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6FF 94 C 2.3.14 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow. 97 C 2.3.15 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 98 C 2.3.16 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 100 C 2.4 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Suspensionskultur 102 C 2.4.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 102 C 2.4.2 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 103 C 2.4.3 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose FF 103 C 2.4.4 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 105 C 2.4.5 Gelfiltration an Superdex 75 106 C 2.4.6 SDS-Page 107 C 2.4.7 Reinigungsbilanz 108 C 2.5 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Blattmaterial 109 C 2.5.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 109 C 2.5.2 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 110 C 2.5.3 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose FF 110 C 2.5.4 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 112 C 2.5.5 Gelfiltration an Superdex 75 114 C 2.5.6 SDS-Page 115 C 2.5.7 Reinigungsbilanz 117 C 2.6 Stabilität bei -20*C 118 C 2.7 Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 118 D Diskussion 121 D 1 Rekombinante Form der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase aus D. lanata. 121 Inhaltsverzeichnis D 1.1 Substratspezifität 121 D 1.1.1 Steroide mit ß-ständiger C3-Hydroxylgruppe 122 D 1.1.2 Steroide mit a-ständiger C3-Hydroxylgruppe 123 D 1.1.3 17ß-Oxidoreduktaseaktivität 124 D 1.1.4. Reduktionsreaktionen der pQ3ß-HSD 124 D1.2Cosubstratspezifität 127 D 1.3 Inhibierung durch zweiwertige Metallionen 128 D 1.4 pH-Optimum und isoelektrischer Punkt 128 D 1.5 Temperaturoptimum 129 D 1.6 Enzymkinetik 130 D 1.7 Untersuchungen der pQ3ß-HSD bezüglich Ketosteroidisomeraseaktivität 132 D2 Native 3ß-HSD aus Erysimum crepidifolium 138 D 2.1 Vorversuche zur Reinigung der Ecre3ß-HSD 138 D 2.1.1 Vorversuche mit Pregnenolon und 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 140 D 2.2 pH-Optimum 142 D 2.3 Stabilität 143 D 2.4 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Suspensionskultur 143 D 2.5 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus £. crepidifolium - Blattmaterial 145 D 2.6 Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 148 E Zusammenfassung 151 ESummary 152 F Literaturverzeichnis 153 G Anhang 161 G 1. Abkürzungsverzeichnis 161 G2. Abbildungsverzeichnis 162 G 3. Tabellenverzeichnis 166 G4. Publikationsliste 167 Anhang G 2. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Gemeinsame Zuckerkomponenten der herzwirksamen Glykoside aus Erysimum und Digitalis 5 Abbildung 2 Postulierter Biosyntheseweg des Cardenolidgrundgerüstes in Digitalis.» Abbildung 3 Reaktionsmechanismus der tierischen 3ß-HSD am Beispiel von Pregnenolon als Substrat 11 Abbildung 4 DC des Aktivitätstests pQ3ß-HSD mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen und Inkubationszeiten 40 Abbildung 5 Getestete Substrate der pQ3ß-HSD 42 Abbildung 6 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 43 Abbildung 7 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 44 Abbildung 8 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 21-OH-Pregnenolon als Substrat. 44 Abbildung 9 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5-Androsten-3ß-ol-17-on als Substrat 45 Abbildung 10 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Xysmalogenin als Substrat 45 Abbildung 11 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Digitoxigenin als Substrat 46 Abbildung 12 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Cholesterol als Substrat 46 Abbildung 13 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3a-ol-20-on als Substrat 47 Abbildung 14 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3a-ol-20-on als Substrat 48 Abbildung 15 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Testosteron als Substrat 48 Abbildung 16 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3,20-dion als Substrat 49 Abbildung 17 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3,20-dion als Substrat 50 Abbildung 18 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Progesteron als Substrat 50 Abbildung 19 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit4-Androsten-3,17-dion als Substrat 51 Abbildung 20 Diagramm des Stabilitätstests bei 4 'C. Die spezifische Aktivität pQ3ß- HSD an verschiedenen Tagen 53 Abbildung 21 Diagramm der pH-Optimum-Bestimmung der pQ3ß-HSD für die Oxidationsreaktion 54 Abbildung 22 Diagramm der pH-Optimum-Bestimmung der pQ3ß-HSD für die Reduktionsreaktion 55 Abbildung 23 Diagramm der Bestimmung des Temperaturoptimums der Oxidationsreaktion von pQ3ß-HSD 56 Abbildung 24 Diagramm der Bestimmung des Temperaturoptimums der Reduktionsreaktion von pQ3ß-HSD 57 Abbildung 25 Diagramm des Einflusses zweiwertiger Metallionen auf die Aktivität derpQ3ß-HSD 57 Abbildung 26 lEF-Gel der pQ3ß-HSD nach Silberfärbung 58 Abbildung 27 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat und Hanes-Plot 60 Abbildung 28 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol- 20-on als Substrat und Hanes-Plot 60 162 Anhang Abbildung 29 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3ß-ol- 20-on als Substrat und Hanes-Plot 61 Abbildung 30 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Androstenolon als Substrat und Hanes-Plot 61 Abbildung 31 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Testosteron als Substrat und Hanes-Plot 62 Abbildung 32 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3,20- dion als Substrat und Hanes-Plot 63 Abbildung 33 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3,20- dion als Substrat und Hanes-Plot 63 Abbildung 34 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat und Hanes-Plot 64 Abbildung 35 Hanes-Auftragung von NAD 65 Abbildung 36 Hanes-Auftragung von NADH 65 Abbildung 37 Diagramm des Vergleiches von pQ3ß-HSD mit Rohextrakt (RE) von Digitalis lanata 67 Abbildung 38 Diagramm der Ketosteroidisomeraseaktivität und Autoisomerisierung in D. lanata bei verschiedenen Proteinkonzentrationen 69 Abbildung 39 Diagramm der Zeitkinetik mit Isoprogesteron als Substrat bei 37 'C (KSI-Bedingungen) 70 Abbildung 40 Diagramm der Zeitkinetik pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat bei 50 "C (3ß-HSD-Bedingungen) 70 Abbildung 41 Diagramm der Untersuchung von pQ3ß-HSD auf KSI-Aktivität mit verschiedenen Substraten 72 Abbildung 42 Diagramm der Zeitkinetik pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat und verschiedenen Cosubstraten 73 Abbildung 43 DC der Reaktion der Negativkontrolle (endogene Bakterienenzyme) mit 5ß-Pregnan-3,20-dion und 5ß-Pregnan-3a-ol-20-on als Substrate 74 Abbildung 44 Diagramm der Reaktion der Negativkontrollen (endogene Bakterienenzyme) der Substrate Isoprogesteron und Testosteron verglichen mit der Reaktion von pQ3ß-HSD 75 Abbildung 45 DC des Aktivitätstests von Eall3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat. 77 Abbildung 46 DC des Aktivitätstests von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat. 77 Abbildung 47 DC der in E. crepidifolium enthaltenen herzwirksamen Glykoside 78 Abbildung 48 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei verschiedenen Proteinkonzentrationen und Inkubation über Nacht 79 Abbildung 49 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei verschiedenen Inkubationszeiten und gleich bleibender Proteinkonzentration. .80 Abbildung 50 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei 25 - 70%iger Ammoniumsulfatfällung 81 Abbildung 51 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat zur Untersuchung der Salzabhängigkeit. 82 Abbildung 52 Bestimmung der Aktivität mit NaPi pH 6,0 - 7,8 bei 2,5 h lnkubation.83 Abbildung 53 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat im Extraktionspuffervergleich bei 2 h Inkubation 84 Abbildung 54 Thermische Behandlung des Rohextraktes von E. crepidifolium 85 Abbildung 55 Diagramm zur Bestimmung des Einflusses des Proteingehalts auf die Aktivität für Ecre3ß-HSD 86 163 Anhang Abbildung 56 Diagramm zur Ermittlung des linearen Bereiches der Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Inkubationszeit für Ecre3ß-HSD 87 Abbildung 57 DC der Reaktionen von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon und Testosteron als Substrate 88 Abbildung 58 DC der Reaktionen von Ecre3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on und 5ß-Pregnan-3,20-dion als Substrate 89 Abbildung 59 Diagramm zur Ermittlung des pH-Optimums der Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat 90 Abbildung 60 Diagramm zur Ermittlung des pH-Optimums der Ecre3ß-HSD mit 5ß- Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 91 Abbildung 61 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die Substrate Pregnenolon und 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on an Tag 0 der Stabilitätsprüfung mit verschiedenen Pufferzusätzen 92 Abbildung 62 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die Stabilitätsprüfung mit Pregnenolon als Substrat 93 Abbildung 63 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die Stabilitätsprüfung mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 93 Abbildung 64 Elutionsprofil an Phenylsepharose 6FF mit 0,8M (NH4 2SO4 95 Abbildung 65 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß- HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 95 Abbildung 66 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an Phenylsepharose 6FF mit 0.75M (NH4)2SO4 96 Abbildung 67 Diagramm der Aktivität der Ecre3ß-HSD1 vor und nach Säulenchromatographie an Phenylsepharose 6FF 96 Abbildung 68 Elutionsprofil an SP Sepharose Fast Flow mit 0,5 M NaCI 97 Abbildung 69 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß- HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 98 Abbildung 70 Elutionsprofil an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI 99 Abbildung 71 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß- HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 99 Abbildung 72 Elutionsprofil an Source 30Q mit 0,5 M NaCI 100 Abbildung 73 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß- HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 101 Abbildung 74 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung der Ecre3ß-HSD1 aus dem Proteinrohextrakt bei Reinigung 1 102 Abbildung 75 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an SP Sepharose Fast Flow mit 0,5 M NaCI bei Reinigung 1 104 Abbildung 76 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow bei Reinigung 1 104 Abbildung 77 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI bei Reinigung 1 105 Abbildung 78 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP bei Reinigung 1 106 Abbildung 79 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP bei Reinigung 1 107 Abbildung 80 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung der Ecre3ß-HSD1 aus dem Proteinrohextrakt bei Reinigung 2 109 Abbildung 81 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an SP Sepharose Fast Flow mit 0.5 M NaCI Reinigung 2 111 164 Anhang Abbildung 82 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow Reinigung 2, 111 Abbildung 83 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI Reinigung 2 112 Abbildung 84 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP Reinigung 2 113 Abbildung 85 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an Superdex 75 114 Abbildung 86 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Gelfiltration an Superdex 75 115 Abbildung 87 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP bei Reinigung 2 116 Abbildung 88 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Gelfiltration an Superdex 75. 116 Abbildung 89 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Stabilitätsprüfung bei-20 "C 118 Abbildung 90 DC der Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und Isoprogesteron als Substrate 119 Abbildung 91 DC der Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 mit 5ß- Pregnan-3,20-dion und Testosteron als Substrate 120 Abbildung 92 Strukturmerkmale untersuchter Substrate 121 Abbildung 93 Zusammenspiel von 3a-HSD und 5a-Reduktase in der Ratte (nach Wiebe et al., 1994) 125 Abbildung 94 Allgemeiner Mechanismus der nicht-enzymatischen Isomerisierung nach Houck und Pollack (2003) 135 Abbildung 95 Reaktionsmechanismus der Ketosteroidisomerase nach Pollack (2004) 136 165 Anhang G 3. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Ausgewählte cardenolidführende Pflanzenfamilien und ihre Vertreter nach Hansel und Sticher (2004) 1 Tabelle 2: Inhaltsstoffgruppen der Gattungen Digitalis und Erysimum neben den Cardenoliden 3 Tabelle 3: Cardenolidgrundgerüst und die in den Gattungen Digitalis und Erysimum vorkommenden Aglyka, abgewandelt nach Luckner und Wichtl (2000) 4 Tabelle 4: Hauptcardenolide in E. crepidifolium 7 Tabelle 5: Aktivität mit verschiedenen Cosubstraten 52 Tabelle 6: Km- und VmarWerte pQ3ß-HSD 66 Tabelle 7: Bilanz der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus Suspensionskultur von E. crepidifolium 108 Tabelle 8: Bilanz der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus Blattmaterial von E. crepidifolium 117 Tabelle 9: Enzyme für die Umwandlung von 5a- und 5ß-Pregnanen in Digitalis. 125 Tabelle 10: Temperaturoptima der Hydroxysteroid-Oxidoreduktasen aus D/g/ta/Js.130 Tabelle 11: Substrate der pQ3ß-HSD und ihre kinetischen Konstanten im Vergleich mit den von Finsterbusch et al. (1999) bestimmten Parameter 131 Tabelle 12: Vergleich der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium Suspensionskultur und Blattmaterial 146 Tabelle 13: Gegenüberstellung einiger Eigenschaften der Ecre3ß-HSD1 und Dlan3ß- HSD (Finsterbusch, 1999) 150 166
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