Differentielle Regulation der Connexin Biosynthese nach chronischer Stimulation neonataler Kardiomyozyten
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1 Einleitung 7
1.1 Das Myokard - ein fiinktionelles Synzytium 7
1.2 Funktion und Nomenklatur der Connexin Proteine 8
1.3 Kardiale Connexin Proteine 9
1.4 Strukturaufbau der Gap junction Kanäle 10
1.5 Umsatz der Gap junction Proteine 13
1.5.1 Lokalisation von Connexin Genen 13
1.5.2 Die Regulation der Transkription und Translation von Connexin Genen 14
1.5.3 Oligomerisation der Connexine und Ausbildung von Gap junction 15
1.5.4 Abbau der Gap junction 18
1.5.5 Regulation der Connexin Expression durch TNFa 19
1.6 MAPK assoziierte Signaltransduktion 20
1.7. G-Protein gekoppelte Signaltransduktion 22
1.8 Die Protein Kinase C Familie 23
1.9 Die Protein Kinase A 26
1.10 Expression von Gap junction bei unterschiedlichen kardialen Erkrankungen 30
1.10.1 Expression von Gap junction bei akuter kardialer Ischämie 30
1.10.2 Expression von Gap junction bei chronischer kardialer Ischäme 31
1.10.3 Expression von Gap junction bei chronischer Herzinsuffizienz 31
1.11. Bedeutung inflammatorischer Zytokine 32
Fokussierung auf TNFa bei systemischen inflammatorischen Erkrankungen
2 Material 35
2.1 Zellkulturmedien 35
2.1.1 Bezugsquellen der verwendeten Bestandteile 35
2.2 Chemikalien und Lösungen 35
2.2.1 Bezugsquellen der verwendeten Antikörper und Chemikalien 35
2.3 Puffer und Lösungen 37
2.4 Geräte und Laborbedarf 38
3
3 Methoden 40
3.1 Isolierung von Herzmuskelzellen 40
3.1.1 Versuchstiere 40
3.1.2 Präparation und Kultivierung neonataler Herzmuskelzellen 40
3.2 Behandlung der Zellkulturen 43
3.3 Lyse der Zellen 43
3.4 Proteinbestimmung 44
3.4.1 Probenvorbereitung 44
3.4.2 Verdünnung und Probenbestimmung nach BCA-Assay 44
3.4.2.1 Prinzip des Bicinchinonsäure (BCA) - Assay 44
3.4.2.2 Durchführung 44
3.5 SDS-Polyacrylamid-Gel Elektrophorese (SDS-PAGE) 45
3.5.1 Prinzip 45
3.5.2 Vorbereitung der Gele 46
3.5.3 Durchführung der Gelelektrophorese 47
3.5.4 Western Blot Verfahren 47
3.5.5 Proteinfärbung 48
3.5.6 Immunologische Nachweismethode nach Western Blot 48
3.6 Immunhistochemische Zellkulturfärbung 50
3.7 Densitometrische Auswertung der Western Blots 51
3.8 Statistische Auswertung 51
4 Ergebnisse 52
4.1 Einfluss der MAPK-Aktivierung durch TNFa auf die Connexin Biosynthese 52
in neonatalen Kardiomyozyten
4.1.1 Untersuchung von Connexin43 nach Applikation von TNFa ohne und 54
in Anwesenheit des p38-MAPK-Inhibitors SB203580
4.1.2 Untersuchung von Connexin40 und Connexin45 nach Applikation von TNFa 54
4.1.3 Phosphorylierungsrate von Connexin43 nach Applikation von TNFa 57
4.1.4 Immunhistochemische Darstellung von Gap junction aus konfluent kultivierten 59
neonatalen Kardiomyozyten nach Applikation von TNFa
4.2 Einfluss des Protein Kinase C Aktivators Phorbolester (PDD) auf die 61
Connexin-Synthese in neonatalen Kardiomyozyten
4.2.1 Untersuchung von Connexin43 nach Stimulation der Protein Kinase C durch 61
4
Phorbolester ohne und in Anwesenheit des p38-MAPK-Inhibitors SB203580
4.2.2 Untersuchung von Connexin40 und Connexin45 nach Applikation von PDD 64
4.2.3 Phosphorylierungsrate von Connexin43 nach Applikation von PDD 66
4.2.4 Immunhistochemische Darstellung von Gap junction aus konfluent 68
kultivierten neonatalen Kardiomyozyten nach
Inkubation von PDD über 24 Stunden
4.3 Einfluss des Adenylylzyklase/cAMP/PKA Signalweges 69
auf die Connexin Biosynthese
4.3.1 Untersuchung von Connexin43 nach Applikation von db-cAMP 70
4.3.2 Untersuchung von Connexin40 und Connexin45 nach Applikation von db-cAMP 72
4.3.3 Phosphorylierungsrate von Connexin43 nach Applikation von db-cAMP 73
4.3.4 Immunhistochemische Darstellung von Gap junction aus konfluent kultivierten 75
neonatalen Kardiomyozyten nach Applikation von db-cAMP
4.4 Effekt einer direkten Adenylylzyklase Aktivierung durch Forskolin 77
auf die Connexin43 Menge
4.4.1 Untersuchung von Connexin43 nach Applikaktion von Forskolin 78
4.4.2 Untersuchung von Connexin40 und Connexin45 nach Applikation von Forskolin 80
4.4.3 Phosphorylierungsrate von Connexin43 nach Applikation von Forskolin 81
4.4.4 Immunhistochemische Darstellung von Gap junction in konfluent kultivierten 82
neonatalen Kardiomyozyten nach Inkubation von Forskolin über 8 Stunden
4.5 Einfluss von TNFa, PDD, db-cAMP und Forskolin auf die Connexin Biosynthese 84
unter simultaner Inkubation des MEK-1/2 Inhibitors PD98059
4.5.1 Einfluss von TNFa auf die Connexin Biosynthese unter gleichzeitiger 84
Inkubation des MEK-1/2 Inhibitors PD98059
4.5.2 Einfluss von PDD auf die Connexin Biosynthese unter gleichzeitiger 85
Inkubation des MEK-1/2 Inhibitors PD98059
4.5.3 Einfluss von db-cAMP und Forskolin auf die Connexin Biosynthese unter 85
gleichzeitiger Inkubation des MEK-1/2 Inhibitors PD98059
5 Diskussion 88
5.1 Chronische Regulation der Connexin Expression 88
5.2 Regulation der Connexin Biosynthese duch TNFa 90
5.3 Bedeutung der Protein Kinase C auf die Connexin Biosynthese 98
5.4 Bedeutung der Protein Kinase A auf die Connexin Biosynthese 101
5
5.5 Bedeutung von cAMP für die Phosphorylierung von Connexin Proteinen 104
6 Limitationen und Schlussfolgerungen 106
7 Zusammenfassung 107
8 Literaturverzeichnis 111
9 Danksagung 139
6
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