Untersuchung molekularer Mechanismen der transendothelialen Migration von Tumorzellen Bedeutung von Integrin ß 3 und EVA 1
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2007
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1. ZUSAMMENFASSUNG 5
2. SUMMARY 7
3. EINLEITUNG 9
3.1. Metastasierung von Tumoren 9
3.1.1. Metastasekaskade 9
3.1.2. EMT in der Tumorentwicklung 13
3.1.3. An der EMT beteiligte Transkriptionsfaktoren 17
3.1.4. Die Rolle von Adhäsionsmolekülen bei der Metastasierung 19
3.1.5. Migration von Tumorzellen über das Endothel 22
3.2. In vitro Modelle zur Metastasierung 23
3.3. Ziel dieser Arbeit 24
4. ERGEBNISSE 25
4.1. Klassifizierung verschiedener Tumorzelllinien im Hinblick auf transendotheliale
Migration und Invasion in Kollagen in vitro 25
4.2. Identifizierung differenziell exprimierter Gene in ausgewühlten TEM+ und TEM
Tumorzelllinien mittels DNA Mikroarray Analyse 28
4.3. Untersuchung der Bedeutung von Integrin ß3 bei der transendothelialen Migration
von Tumorzellen 33
4.3.1. Untersuchung der endogenen Expression von Integrin ß3 in verschiedenen
Tumorzelllinien 33
4.3.2. Funktionelle Analyse der Rolle von Integrin ß3 bei der transendothelialen
Migration 36
4.3.2.1. Hemmung der TEM verschiedener Tumorzelllinien mittels Blockierung des
zelleigenen Integrin avß3 36
4.3.2.2. RNAi vermittelter Knockdown der Integrin ß3 Expression in 786.0 Zellen. 37
4.3.2.3. Ektopische Expression von Integrin ß3 in TEM A549 Zellen 39
4.4. Untersuchungen an Epithelial v like antigen 1 (EVA1) 41
4.4.1. Untersuchung der endogenen Expression von EVA1 in verschiedenen Geweben
und Tumorzelllinien 41
4.4.2. Funktionelle Analyse der Rolle von EVA1 bei der transendothelialen Migration 42
4.4.2.1. Ektopische Expression von EVA1 in TEM+ Zelllinien 42
4.4.2.2. RNAi vermittelter Knockdown der EVAl Expression in MS751 Zellen 45
4.4.3. Analyse der transkriptionellen Regulation von EVAl durch verschiedene
Transkriptionsfaktoren 49
4.4.3.1. Untersuchung der Beteiligung von Slug, ZEB1 und ZEB2 an der EVA1
Expression 50
4.4.3.2. Untersuchung der Beteiligung von Snail an der EVA / Expression 53
5. DISKUSSION 55
6. MATERIAL UND METHODEN 69
6.1. Material 69
6.1.1. Organismen 69
6.1.1.1. Bakterienstämme 69
6.1.1.2. Humane und Tumorzelllinien 69
6.1.2. Vektoren 71
6.1.3. Oligonukleotide 72
6.1.4. Medien .75
6.1.5. Lösungen 75
6.1.6. Weitere Chemikalien und Enzyme 78
6.1.7. Primäre und sekundäre Antikörper 79
6.1.8. Verbrauchsmaterialien 80
6.1.9. Geräte 81
6.2. Methoden 82
6.2.1. Anzucht der verwendeten Organismen 82
6.2.1.1. Anzucht von Bakterien 82
6.2.1.2. Kultivierung von Zelllinien und HUVEC 82
6.2.2. Allgemeine molekularbiologische Methoden 82
6.2.2.1. Herstellung von Dauerkulturen 82
6.2.2.2. Isolierung von DNA aus Agarosegelen 83
6.2.2.3. Bestimmung der DNA bzw. RNA Konzentration 83
6.2.2.4. DNA Reinigung und Fällung 83
6.2.2.5. DNA Sequenzanalyse .83
6.2.2.6. Plasmidisolierung aus Bakterien 84
6.2.2.7. Herstellung kompetenter Bakterien 84
6.2.2.8. Transformation von Bakterien ...84
6.2.2.9. RNA Isolierung aus Säugerzellen 84
6.2.2.10. Reverse Transkriptase PCR (RT PCR) 85
6.2.2.11.Quantitative Echtzeit PCR (real time RT PCR) 86
6.2.3. Proteinchemische Methoden 86
6.2.3.1. SDS PAGE und Western Blot Analyse ZZZ ZZ ^ZZ Z ...... 86
6.2.3.2. Luziferaseassay zur Bestimmung der Promotoraktivität 86
6.2.4. Methoden zur immuncytologischen Lokalisierung 87
6.2.4.1. Immunfluoreszenzfärbung von fixierten Zellen 87
6.2.4.2. Immunfluoreszenzfärbung von Zellen in Suspension 87
6.2.5. Methoden zur Arbeit mit Säugerzellen 88
6.2.5.1. Zellzahlbestimmung 88
6.2.5.2. Isolierung von HUVEC 88
6.2.5.3. Durchflusszytometrie 88
6.2.5.4. Aggregationsversuch 88
6.2.5.5. Proliferationsversuch 89
6.2.5.6. Adhäsionsversuche 89
6.2.5.7. Invasions und Transendothel Migrationsversuch 90
6.2.5.8. Transfektion von Säugerzellen 90
6.2.6. DNA Mikroarrays und Analyse der differentiellen Genexpression 91
6.2.7. Plasmidklonierungen 92
6.2.7.1. Klonierung von EVAl Expressionsplasmiden 92
6.2.7.2. Klonierung der shRNA gegen Integrin ß3und EVA1 92
6.2.7.3. Klonierung der Promotorkonstrukte für EVA 1 92
7. LITERATUR 93
8. ANHANG 115
8.1. Während der Arbeit erstellte Vektoren 115
8.2. Sequenzen 122
8.3. Mikroarray Daten 124
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