Charakterisierung und Identifizierung eines Fibroblasten-stimulierenden Faktors aus intestinalen Epithelzellen
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2005
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis 5
Abbildungsverzeichnis 11
TabeUenverzeichnis 13
1 Einleitung 15
1.1 Aufbau der Darmwand 15
1.2 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen 17
1.2.1 MorbusCrohn 18
1.2.2 Colitis ulcerosa 20
1.2.3 Ursachen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen . . 23
1.2.4 Ursachen von Stenosen und Strikturen bei IBD 25
1.3 Intestinale Fibroblasten 26
1.4 Rolle und Funktion intestinaler Epithelzellen 29
1.5 Chemokine und ihre Beteiligung bei IBD 30
1.5.1 Interleukin-8 32
1.5.2 Monocyte chemoattractant protein-1 33
1.6 Die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kB 34
2 Arbeitsziele 37
3 Material 41
3.1 Zellkultur 41
3.2 Epithelzellisolation 42
3.3 Fibroblastenisolierung 42
5
5 Inhaltsverzeichnis
3.4 ELISA 43
3.5 Proteinbestimmung 43
3.6 Zentrifugation 43
3.7 Adenovirusinfektion 44
3.8 Immunfluoreszenz 44
3.9 Protein/DNA Anay 44
3.10 Proteinausfällung 45
3.11 Gelfiltrationschromatographie 45
3.12 Gelelektrophorese 45
3.13 Proteinauftrennung 46
3.14 Immunpräzipitation 46
3.15 Verbrauchsmaterialien 47
3.16 Geräte 48
3.17 Nährmedien 50
3.18 Puffer und Lösungen 51
3.18.1 Protein/DNA Array 51
3.18.2 SDS-PAGE 52
3.18.3 Western-Blot 53
4 Methoden 55
4.1 Zellkultur 55
4.1.1 Zelllinien 55
4.1.2 Isolation und Kultur von primären intestinalen Fibroblasten 56
4.2 Epithelzellisolation 57
4.3 Herstellung von konditionierten Medien 58
4.4 Herstellung von Membranpellets 58
4.5 Herstellung von Zytosol und Membranen 60
4.6 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 60
4.7 BCA-Test 61
4.7.1 Lyse der Fibroblasten 62
4.7.2 Proteinbestimmung 62
4.8 Proteindenaturierung 62
4.9 Adenoviruskonstrukt 63
Inhaltsverzeichnis 7
4.10 Immunfluoreszenz 63
4.11 Protein/DNA Airay 64
4.11.1 Kernextraktion 64
4.11.2 Isolierung der an TF gebundenen DNA und Hybridisierung 65
4.12 ProteinausfUllung mit Ammoniumsulfat 66
4.13 Proteinauftrennung 67
4.13.1 Zentrifugenfilter 67
4.13.2 Gelfiltrationschromatographie 68
4.13.3 Proteinsequenzierung 69
4.14 Immunpräzipitation 70
4.15 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 72
4.16 Proteingel 73
4.17 Westem-Blot 73
5 Ergebnisse 75
5.1 Untersuchung der Aktivierung von intestinalen Fibroblasten ... 75
5.1.1 CEC—konditionierte Medien lösen eine starke Aktivierung
von CLPF aus 75
5.1.2 CCD-18Co werden durch CEC-konditionierte Medien sti¬
muliert 77
5.1.3 HT-29 und CaCo-2 konditionierte Medien bewirken eine
schwache Aktivierung von CLPF 79
5.1.4 HT-29 und CaCo-2 konditionierte Medien induzieren ei¬
ne geringe Zytokinsekretion von CCD-18Co 81
5.2 Einfluss von veränderten konditionierten Medien auf die Aktivie¬
rung intestinaler Fibroblasten 83
5.2.1 Der Effekt CEC-konditionierter Medien auf Fibroblasten
ist konzentrationsabhängig 85
5.2.2 Die Denaturierung von konditionierten Medien vermin¬
dert den Fibroblasten-stimulierenden Effekt 85
5.2.3 Eingrenzung der Proteingrösse des CLPF-stimulierenden
Faktors auf einen Bereich zwischen 10 und 30 kDa .... 87
g Inhaltsverzeichnis
5.2.4 Konzentriertes konditioniertes Medium zeigt keinen Sti¬
mulationsverlust von Fibroblasten 89
5.3 Einfluss von NF-kB bei der Aktivierung von intestinalen Fibro¬
blasten durch CEC-konditionierte Medien 92
5.3.1 CEC-konditionierte Medien lösen eine Translokation von
NF-kB in den Zellkern aus 92
5.3.2 IKB-Adenovirus vermittelte Überexpression verhindert die
Aktivierung von NF-kB durch konditionierte Medien ... 92
5.3.3 NF-kB wird durch CEC-konditionierte Medien in Kern¬
extrakten vermehrt nachweisbar 96
5.4 Aufreinigung des für die Fibroblastenaktivierung verantwortlichen
Faktors 98
5.4.1 CEC-konditionierte Medien wurden chromatographisch
aufgetrennt 100
5.4.2 Die massenspektrometnsche Analyse der FPLC-Fraktio-
nen weist Galectin-3 nach 101
5.5 Immunpräzipitation weist Galectin-3 in konditionierten Medien
nach 105
5.6 Rekombinantes Galectin-3 löst eine starke Aktivierung von Fi¬
broblasten aus 105
6 Diskussion 111
6.1 Zusammenfassung 111
6.2 Intestinale Fibroblasten werden durch konditionierte Medien in-
testinaler Epithelzellen aktiviert 112
6.3 Galectin-3-Struktur und Aufbau 114
6.4 Galectin-3 Promotor 115
6.5 Expression von Galectin-3 118
6.6 Galectin-3 und sein Einfluss auf den Zellzyklus 120
6.7 Galectin-3 und Tumoren 122
6.8 Galectin-3 bindet Proteine der Extrazellularmatrix 123
6.9 Galectin—3 und Immunsystem 125
6.10 Galectin-3 bei Morbus Crohn und IBD 127
Inhaltsverzeichnis 9
7 Ausblick 131
Literaturverzeichnis 133
Abkürzungen 153
Kongressbeiträge und Veröffentlichungen 157
Lebenslauf 159
Danksagung 163
10 Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
1.1 Aufbau der Dannwand 17
1.2 Lokalisation des Morbus Crohn 19
1.3 Linksseitiger Morbus Crohn 20
1.4 Endoskopische Aufnahmen von gesunder und pathologisch ver¬
änderter Darmwand bei IBD 21
1.5 Histologische Schnitte von gesunder und pathologisch veränder¬
ter Darmwand bei IBD 22
1.6 Lokalisation der Colitis ulcerosa 23
1.7 Mikroskopische Aufnahmen von intestinalen Fibroblasten .... 28
1.8 NF-kB Aktivierungsweg 36
4.1 MALDI-TOFMS 71
5.1 Stimulation von CLPF mit CEC-konditioniertem Medium 78
5.2 Stimulation von CCD-I8C0 mit CEC-konditioniertem Medium. . 80
5.3 Stimulation der CLPF Zellen mit HT-29 und CaCo-2 konditio-
nierten Medien 82
5.4 Stimulation der CCD-I8C0 Zellen mit HT-29 und CaCo-2 kon-
ditionierten Medien 84
5.5 IL-8 Sekretion von CCD-18C0 nach Inkubation mit Verdünnungs¬
reihen von CEC-konditionierten Medien 86
5.6 IL-8 Sekretion von CCD-I8C0 nach Inkubation mit denaturier¬
tem Medium 88
5.7 Auftrennung des CEC-konditionierten Mediums mittels Zentrifu-
gationsfiltem 90
11
12 Abbildungsverzeichnis
5.8 H^-8 Sekretion von CCD-I8C0 nach Inkubation mit konzentrier¬
ten CEC-konditionierten Medien 91
5.9 Messung der 11^8 Werte bei Kontrollzellen und mit IxB-Adenovirus
transfizierten Zellen 93
5.10 Immunfluoreszenz von CCD-I8C0 nach Inkubation mit unkondi-
tionierten Medien 94
5.11 Immunfluoreszenz von CCD-18C0 zur Überprüfung der Translo-
kation von NF-kB in den Zellkern 95
5.12 Immunfluoreszenz von CCD-I8C0 nach Transfektion mit dem
dominant negativen IicB-Adenovirus und Stimulation mit unkon-
ditionierten Medien 96
5.13 Immunfluoreszenz von CCD-I8C0 nach Transfektion mit dem
dominant negativen iKß-Adenovirus und Stimulation mit CEC-
konditionierten Medien 97
5.14 DNA-/Protein-Array 99
5.15 Chromatogramm der Auftrennung CEC—konditionierter Medien . 102
5.16 Stimulation der Fibroblasten mit FPLC-Fraktionen, Messung der
IL-8 Konzentrationen 103
5.17 Proteingele der FPLC-Auftrennung 104
5.18 Spektrumanalyse des MALDI-TOF 106
5.19 Immunpräzipitation von CEC-konditionierten Medien 107
5.20 Stimulation der Fibroblasten mit rekombinantem Galectin-3 ... 109
Tabellenverzeichnis
4.1 Auflistung der Epithelzellisolationen 59
13
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